北沙参-麦冬配伍体内外化学成分研究

摘要

北沙参为伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr.Schmidt ex Miq.的干燥根，具有养阴清肺，益胃生津的功效，可用于肺热燥咳，劳嗽痰血，热病津伤口渴等症。香豆素是北沙参中的一类主要活性成分。麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogon japonicus(L. f.) Ker-Gawl的干燥块根，有养阴生津、润肺清心之功效，可用于肺燥干咳，阴虚劳嗽，喉痹咽痛等症。皂苷和高异黄酮是麦冬中两类主要的活性成分。北沙参-麦冬是临床常用的滋养肺胃之阴药对，对于二者的配伍目前仅限于药理学作用研究，并未见二者配伍的化学成分研究报道。本研究分为三个部分：
　　第一部分：北沙参-麦冬配伍前后19种化学成分的含量变化。
　　目的：建立北沙参-麦冬合煎液中19种化学成分的HPLC-ESI-MS/MS定量分析方法，并比较两药单煎和合煎19种化学成分的含量变化。
　　方法：采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱（4.6mm×150mm,5μm），配有Agilent C18 column保护柱；柱温：25.0℃；流动相：乙腈(A)和0.3‰的乙酸水溶液(B)；梯度洗脱程序：20％A(0-13 min)，20%-95%A(13-30 min)，95%A(30-30.1 min)；流速：1 mL/min；进样量：10μL。质谱条件 ESI离子源采用正负离子切换监测模式。雾化气（GS1），40 psi；加热气（GS2），50 psi；帘气（CUR），25 psi；温度（TEM），650℃；正离子源喷射电压（IonSpray Voltage Floating），5500 V；负离子源喷射电压（IonSpray Voltage Floating），-4500 V；接口加热，全程通入氮气。MRM模式定量。19种被测成分的监测离子对分别为东莨菪内酯（m/z193.1/133.1）、伞形花内酯（m/z163.0/107.1）、花椒毒酚（m/z203.1/147.1）、异紫花前胡内酯（m/z247.3/175.1）、水合氧化前胡素（ m/z305.2/203.1）、补骨脂素（ m/z187.0/131.1）、花椒毒素（m/z217.1/174.1）、麦冬皂苷C（m/z851.5/393.4）、麦冬皂苷Ra（m/z719.5/393.3）、异茴芹内酯（m/z247.2/217.1）、佛手柑内酯（m/z217.1/202.1）、氧化前胡素（m/z287.1/203.1）、麦冬皂苷D（m/z855.7/287.2）、欧前胡素（m/z271.1/203.0）、异欧前胡素（m/z271.1/203.0）、甲基麦冬高异黄酮A（m/z341.1/219.1）、甲基麦冬二氢高异黄酮A（m/z343.1/135.0）、甲基麦冬二氢高异黄酮B（m/z329.1/121.1）和麦冬黄烷酮C（m/z354.9/192.7）。用所建立的方法对北沙参单煎液、麦冬单煎液和北沙参麦冬合煎液中的19种化学成分进行分析。
　　结果：19种化学成分在测定浓度范围内均具有良好的线性关系，相关系数R2﹥0.9991；仪器精密度RSD值均小于1.9%，批内精密度（RSD）和批间精密度（RSD）分别小于3.8%和3.6%；平均回收率范围为97.8～104.4%；稳定性、检测限和定量限均符合要求。样品测定结果表明，配伍对北沙参、麦冬中的化学成分的含量确有影响，香豆素类在北沙参-麦冬药材配伍后含量下降，麦冬甾体皂苷类和麦冬高异黄酮类在北沙参-麦冬药材配伍后含量上升。
　　结论：本法简便、快速、专属性好，可用于北沙参-麦冬配伍前后19种化学成分的含量测定，为研究中药配伍体外化学成分量的变化提供了依据。
　　第二部分：北沙参-麦冬配伍前后的化学成分鉴定。
　　目的：总结香豆素类、麦冬皂苷类和高异黄酮类的质谱裂解规律，建立灵敏、有效的UPLC/qTOF-MS分析方法，用于北沙参-麦冬配伍前后的化学成分的鉴定和比较。
　　方法：采用UPLC/qTOF-MS技术对混合对照品溶液、北沙参单煎液、麦冬单煎液、北沙参麦冬合煎液和空白溶剂进行 TOF-MS-IDA-8MS/MS扫描，获取全扫描质量色谱图，根据对照品的一级、二级质谱信息总结这一类化合物的质谱裂解规律。在此基础上，采用PeakView2.0数据处理软件中的“MasterView”分析化合物保留时间、精确分子质量、元素组成、同位素丰度和一级、二级质谱信息，鉴定样品中的化学成分。色谱条件：Phenomenex Kinetex2.6μC18100A(50×3.0 mm，2.6μm)；柱前连接在线过滤器；柱温为室温；流动相为0.03%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脱；流速为0.4 mL/min。进样量为2μL。
　　结果：鉴定了北沙参中48种香豆素类化合物，麦冬中11种甾体皂苷类和27种高异黄酮类化合物，北沙参-麦冬药对中44种香豆素类、11种甾体皂苷类和32种高异黄酮类化合物，并总结了配伍前后化学成分15处不同。其中22种化合物与对照品比对可确证其化学结构，其余71种化合物通过分析元素组成、同位素丰度和一级、二级质谱信息被鉴定，误差范围均在±5 ppm内。
　　结论：本法灵敏、有效，已成功用于北沙参-麦冬配伍前后化学成分的鉴定和比较，发现北沙参麦冬配伍前后化学成分发生变化：在北沙参单煎液中已经鉴定到，而北沙参-麦冬合煎液中未能鉴定的8个香豆素类化合物；北沙参和麦冬单煎液中未鉴定到，而北沙参-麦冬合煎液中已鉴定到3个香豆素类化合物和4个高异黄酮类化合物。该研究为中药配伍物质基础研究提供了依据。
　　第三部分：北沙参-麦冬配伍前后在大鼠体内的吸收组分与其代谢物鉴定。
　　目的：采用UPLC/qTOF-MS技术，鉴定并比较北沙参-麦冬配伍前后在大鼠体内尿液、血浆和胆汁中的代谢物，探索其活性成分的体内代谢途径。
　　方法：⑴北沙参灌胃液的制备：将北沙参按照传统水煎工艺提取，加入4倍量无水乙醇沉淀，抽滤，减压除醇，用水稀释至相当于2 g/mL的原药材。麦冬灌胃液、北沙参-麦冬（1:1）灌胃液同法制备。⑵生物样品的采集和预处理：取12只雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250±10 g，随机分为4组，空白组3只，北沙参组3只，麦冬组3只，北沙参-麦冬组3只，按体重以1 mL/100 g的给药量，灌胃给与大鼠，分别采集给药后72 h的尿液、0.08、0.17、0.33、0.5、1、2、4、6、8、10、12和24 h时的血浆样品和24 h的胆汁样品，分别合并所有的尿样、胆汁和血浆样品。将合并的尿液和胆汁样品分别用3倍量的乙酸乙酯萃取，萃取3次，每次10 min。合并乙酸乙酯层，减压干燥，残渣用甲醇溶解。在合并的血浆样品中加入3倍量的乙腈，离心取上清液，氮气流吹干，加入50%的乙腈复溶。⑶样品分析条件：采用 UPLC/qTOF-MS技术分析样品。色谱柱为Phenomenex Kinetex2.6μC18100A(50×3.0 mm，2.6μm)；柱温为室温；流动相为0.03%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脱；高分辨质谱采用ESI源，正、负离子模式，全扫描采集，采用动态背景扣除和信息依赖采集触发二级碎片的采集，每一循环采集8个最强峰的二级质谱图。⑷代谢物发现和鉴定的步骤：首先结合文献，建立北沙参、麦冬中香豆素类、甾体皂苷类和高异黄酮类已知化合物的信息库。然后用PeakView2.0软件寻找主要的吸收组分。再将这些吸收组分按照结构的相似性分类，选择每类中的典型化合物。接着采用Metabolitepilot1.5软件，对这些典型化合物进行分析，寻找尿样、胆汁和血浆样品中这些化合物的代谢物。最后根据香豆素类的裂解规律和化合物的极性，对这些代谢物的结构进行解析，推断可能的代谢产物，并比较配伍前后代谢物是否发生改变。
　　结果：选取东莨菪内酯、异茴芹内酯、异紫花前胡内酯、紫花前胡苷、欧前胡素、水合氧化前胡素、麦冬皂苷D’、甲基麦冬高异黄酮A和麦冬黄烷酮E为代表，用Metabolitepilot1.5软件以这些代表性的化合物为模板进行分析，寻找其代谢物，共鉴定出231种成分，主要的代谢类型有氧化、氢化、内部水解、去饱和、去甲基化和甲基化等。并且发现北沙参-麦冬配伍给药前后在大鼠体内共有136种（62种香豆素类、33种甾体皂苷类和41种高异黄酮类化合物）不同的吸收组分和代谢物。
　　结论：本研究采用UPLC/qTOF-MS技术，成功发现和鉴定了北沙参-麦冬配伍前后在大鼠体内的代谢物，结果表明配伍影响了药材在大鼠体内的代谢，为中药配伍体内过程的阐明奠定了基础。

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引言

第一部分北沙参-麦冬配伍前后19种化学成分的含量变化

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分北沙参-麦冬配伍前后的化学成分鉴定

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分北沙参-麦冬配伍前后在大鼠体内的吸收组分与其代谢物鉴定

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:液质联用技术在中药配伍研究中的应用

致谢

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