基于色谱联用技术的蛇床子及其复方制剂中多组分同时分析与药物代谢动力学研究

摘要

本研究首先建立了同时测定蛇床子中16种活性成分的LC-ESI-MS/MS分析方法，该方法可用于蛇床子药材的全面质量控制，提高了蛇床子药材的质量控制水平;在本研究中，还建立了灵敏度高，专属性强的UPLC-ESI-MS/MS法同时测定大鼠血浆样品中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素等6种香豆素类活性成分，并将该方法应用于大鼠灌胃给予蛇床子提取物后血浆中6种成分的药代动力学研究，为中药材蛇床子的临床应用提供参考依据;还建立了同时测定八子补肾胶囊中14种活性成分的UPLC-ESI-MS/MS定量分析方法，并应用于八子补肾胶囊的质量控制;建立了同时测定蛇床子中7种香豆素类活性成分的GC-MS-SIM定量分析方法，为中药材蛇床子的质量控制提供新的分析手段;采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析技术，对大鼠灌胃给予佛手柑内酯后尿液和胆汁样品中的代谢产物进行了鉴定研究，推测出佛手柑内酯在大鼠体内的代谢规律和主要代谢途径，为佛手柑内酯的临床应用提供重要参考。本文主要从以下几部分展开论述:
　　第一部分 HPLC-ESI-MS/MS法同时测定蛇床子中16种活性成分的含量及其质量表征
　　目的:建立一种快速、准确的LC-ESI-MS/MS定量分析方法，可同时分离、测定不同来源的蛇床子药材中16种活性成分（9种香豆素类，包括蛇床子素、花椒毒酚、异补骨脂素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、花椒毒素、二氢欧山芹素、欧前胡素和异欧前胡素;7种黄酮类，包括山奈酚、异鼠李素、槲皮苷、木犀草素、槲皮素、橙皮苷和芦丁），并用于12批不同来源蛇床子药材的质量分析。
　　方法:液相色谱柱Waters XBridge C18柱（250×4.6 mm，5μm）;流动相为A:乙腈，B:水（含有0.1％乙酸），梯度洗脱，分析时间为15 min，流速为1.0 mL/min。质谱采用电喷雾离子源（ESI源），TurboV离子源，源温度(TEM)550℃，采用多反应离子监测(MRM)，进行正负离子同时检测。源喷射电压(IS)为4500 V和-4500 V，雾化温度为650℃，雾化气(GS1，N2)为50 psi，辅助气(GS2，N2)为60 psi，气帘气(N2)为25 psi。接口持续加热，全程氮气通入状态。每个离子对的滞留时间为40 ms。DP为10/-10 V;CXP为5/-5 V。全扫描相对分子量范围为100～1000。
　　结果:16种活性成分的线性关系良好（r2≥0.9987），检测限和定量限分别为1.71～7.29 ng/mL和5.10～20.01 ng/mL。日内日间精密度分别为0.5～3.6％和0.6～3.5％。稳定性和重复性的相对标准偏差分别为0.5～3.9％和0.5～3.2％。平均回收率范围在96.89％～101.6％。
　　结论:本研究首次建立了HPLC-ESI-MS/MS法，采用在一个分析周期内正负离子多次切换的检测模式，同时定性和定量分析蛇床子药材中16种有效成分，并将该方法应用于12批不同来源药材的质量分析，该方法操作简便、快速、灵敏度高、专属性强，可为蛇床子药材的质量控制提供参考依据。从样品的含量测定结果来看，各产地之间12批次蛇床子药材的质量差异大，提示药材质量受产地及其种植地天气状况等的影响。因而有必要对药材的产地及采集等进行跟踪检测，以保证蛇床子药材质量和药效的稳定。
　　第二部分 UPLC-ESI-MS/MS法同时测定大鼠口服蛇床子提取物后血浆中6种成分及药代动力学研究
　　目的:建立一种同时测定大鼠血浆中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素等6种香豆素类化合物含量的UPLC-ESI-MS/MS方法，成功的应用于大鼠灌胃给予蛇床子提取物后血浆中6种成分的药代动力学研究，并建立其药-时曲线，阐明药动学参数与特征。
　　方法:大鼠灌胃给与蛇床子提取物(6 mL/kg)后，分别于给药后0.08，0.17,0.33,0.5,0.75,1,1.5,2,3,4,6,9,12,18,24和30 h眼内眦静脉丛取血0.3 mL，制备血浆样品，采用甲醇直接沉淀蛋白法进行样品预处理，磺胺甲噁唑为内标。
　　结果:大鼠口服灌胃给予蛇床子提取物后，血浆中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素等6种待测成分在大鼠体内的药代动力学药-时曲线有所差异，其中，欧前胡素吸收最快，达峰时间为给药后1 h;异欧前胡素在给药后1.5 h达到最高血药浓度;花椒毒素达峰时间为给药后2h左右;异茴芹内酯和佛手柑内酯吸收稍慢，达峰时间为给药后3 h;蛇床子素吸收最慢，于给药后6h达到血浆峰浓度。总体来说，大鼠灌胃给予蛇床子提取物后，6种待测成分在体内吸收均较迅速，5 min均可检测到，并且具有相近的消除速率。
　　结论:本研究建立了UPLC-ESI-MS/MS法同时测定大鼠血浆中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素和异欧前胡素的含量，并应用于蛇床子中6种活性成分在大鼠体内的药代动力学研究。该方法操作简单、快速、专属性强、灵敏度高，对蛇床子药材的体内定量分析具有重要意义，有益于传统中药蛇床子的临床应用。
　　第三部分 UPLC-ESI-MS/MS法测定八子补肾胶囊中14种成分含量
　　目的:建立UPLC-ESI-MS/MS法测定八子补肾胶囊中花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、异欧前胡素、五味子甲素、五味子醇甲、金丝桃苷、槲皮苷、木犀草素、山奈酚、异鼠李素和熊果酸等14种成分的含量。
　　方法:取八子补肾胶囊20粒，倾出内容物，研细，混匀，取粉末约4.00 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70％乙醇80 mL，精密称定，超声(功率:100W;频率:25kHz)处理60 min，放冷，再精密称定，用70％乙醇补充损失的重量，摇匀，离心，用0.2μm滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液，负离子模式直接进样2μL，正离子模式稀释40倍后进样2μL。
　　结果:在5min内八子补肾胶囊中14种主要成分实现良好分离，峰面积与浓度呈良好的线性关系（r2≥0.9989）;花椒毒素、异茴芹内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、异欧前胡素、五味子甲素、五味子醇甲、金丝桃苷、槲皮苷、木犀草素、山奈酚、异鼠李素和熊果酸加样回收率分别为99.56％,99.47％,99.69％,101.2％,99.89％,100.2％,99.86％,101.2％,98.69％，101.1％，98.65％，99.75％，101.9％和97.89％(n=3)。RSD值分别为1.1％,0.9％,1.3％,1.1％,1.5％,1.4％,1.4％,0.8％,1.7％,1.7％,1.9％,1.5％,1.6％和2.1％。
　　结论:该方法操作简便、准确、灵敏度高、重现性好，专属性强，可用于八子补肾胶囊的质量控制。
　　第四部分 GC-MS-SIM法同时测定蛇床子中7种香豆素类活性成分的含量
　　目的:建立一种快速、准确的GC-MS-SIM定量分析方法，同时分离、测定不同来源的蛇床子药材中异补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、蛇床子素、异茴芹内酯、欧前胡素和二氢欧山芹醇等7种香豆素类活性成分的含量，并应用于12批不同来源蛇床子药材的质量分析。
　　方法:控制色谱柱参数分析样品。
　　结果:7种香豆素类活性成分的线性关系良好（r2≥0.9986），检测限和定量限分别为1.06～10.11 ng/mL和3.21～29.88 ng/mL。日内日间精密度分别为0.7～2.5％和1.2～3.3％。稳定性和重复性的相对标准偏差分别为0.5～2.5％和0.8～3.0％。平均回收率范围为92.38％～100.53％。
　　结论:本研究首次建立了GC-MS-SIM法，同时定性和定量分析蛇床子药材中7种香豆素类有效成分，并将该方法应用于12批不同来源药材的质量分析，该方法简便、快速、灵敏度高、专属性好，可为蛇床子药材的质量控制提供参考依据。从样品的含量测定结果来看，各产地之间12批次蛇床子药材的质量差异大，提示药材质量受产地及其种植地天气状况等的影响。因而有必要对药材的产地及采集等进行跟踪检测，以保证蛇床子药材质量和药效的稳定。
　　第五部分 UPLC-Q-TOF-MS/MS法分析佛手柑内酯在大鼠体内的代谢产物
　　目的:建立一种UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法，对大鼠灌胃给予佛手柑内酯后尿液和胆汁样品中的代谢产物进行鉴定研究，推测佛手柑内酯在体内的代谢规律和主要代谢途径。
　　方法:大鼠灌胃给予佛手柑内酯，收集给药前后的尿液和胆汁，采用Waters Ostro96孔板法处理样品。
　　结果:尿液和胆汁中共发现佛手柑内酯大鼠体内可能的代谢产物17个，其中尿液中有17个，胆汁中有16个，胆汁中的16个代谢产物在尿液中均被发现。佛手柑内酯在胆汁和尿液中的Ⅰ相代谢产物有6个，主要为双键氧化，氧化脱甲基，水解等;Ⅱ相代谢产物有11个，主要是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化。佛手柑内酯在尿液和胆汁中的代谢物种类并无明显差异，只是代谢物的含量不同。
　　结论:本研究首次建立了UPLC-Q-TOF-MS/MS法，对大鼠灌胃给予佛手柑内酯后尿液和胆汁样品中的代谢产物进行鉴定研究，推测出佛手柑内酯在体内的代谢规律和主要代谢途径。该方法简便、快速、灵敏度高、专属性好，可用于体内微量成分的分析鉴定。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 HPLC-ESI-MS／MS法同时测定蛇床子中16种活性成分的含量及其质量表征

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 UPLC-ESI-MS／MS法同时测定大鼠口服蛇床子提取物后血浆中6种成分及药代动力学研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 UPLC-ESI-MS／MS法测定八子补肾胶囊中14种成分含量

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 GC-MS-SIM法同时测定蛇床子中7种香豆素类活性成分的含量

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第五部分 UPLC-Q-TOF-MS／MS法分析佛手柑内酯在大鼠体内的代谢产物

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 中药材蛇床子的化学成分及药理作用研究概况

综述二 新型药用辅料羟丙基倍他环糊精研究概况

致谢

个人简历