八肽胆囊收缩素在cDC调节Treg细胞功能中的作用

摘要

本课题使用免疫磁珠法分选健康人外周血来源的CD14+单核细胞，体外诱导其分化为iDC和mDC，观察CCK-8体外作用对不同状态的cDC的表型调节作用及经CCK-8处理后不同状态的cDC对Treg细胞功能的影响，并进一步探讨CCK-8发挥此调节作用的分子机制和受体机制。此外，本课题还观察了CCK-8在炎症介质PGE2调节的Treg细胞分化和功能中的作用，从而进一步观察CCK-8的免疫调节作用。
　　本文主要分四部分展开研究：
　　第一部分 八肽胆囊收缩素对人外周血cDC表型的影响
　　目的:本部分研究使用免疫磁珠法分选健康人外周血来源的CD14+单核细胞，诱导其向cDC的iDC和mDC分化，以观察CCK-8对iDC和mDC的表型调节作用。
　　方法:1.免疫磁珠法分选健康人外周血来源的CD14+单核细胞，用流式细胞术鉴定CD14+单核细胞纯度。分选后的CD14+单核细胞，在含人重组GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(50ng/ml)和10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基中培养6天，获得iDC，用流式细胞术检测CD1a+CD14-细胞阳性率，证明细胞诱导成功，给予LPS(1μg/ml)刺激48h，获得mDC。
　　2.CCK-8对iDC和mDC的DC-SIGN CD209和成熟标记CD83的表达的影响。
　　3.CCK-8对不同状态的DC CD80、CD86、HLA-DR和GITR-L表达的影响。
　　结论:本实验证实CCK-8可以抑制iDC和mDC表达DC-SIGN CD209、CD83、CD80、CD86、HLA-DR和GITR-L，表明CCK-8对iDC和mDC的表型有抑制作用。cDC除了具有iDC和mDC两种状态之外，还存在半成熟状态(semi-mature DC)，即tDC，其表达的表面分子水平比mDC表达水平低，上述结果提示CCK-8可以诱导半成熟状态的DC即致耐受DC(tolerogenicDC，tDC)生成。
　　第二部分 八肽胆囊收缩素对cDC调节Treg细胞功能的影响
　　目的:本部分研究观察了CCK-8对iDC/mDC调节Treg功能的影响。实验采用DC与Treg共培养的方法，观察经CCK-8处理的DC在Treg细胞功能调节中发挥何种作用，以期进一步揭示CCK-8在免疫调节中的作用。
　　方法:1.免疫磁珠法分选人外周血CD4+CD25+Treg细胞和CD8+T细胞，流式细胞术鉴定纯度。
　　2.CCK-8对DC调节Treg细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。
　　3.CCK-8对DC调节Treg增殖能力的影响。
　　4.CCK-8对mDC调节的Treg细胞对效应T细胞增殖的影响。
　　结论:本实验证实CCK-8作用的mDC既可以促进Treg细胞的抑制功能，又可以促进Treg细胞增殖。由于CCK-8抑制mDC的表型，因此本研究推测CCK-8的上述作用可能与其诱导tDC的生成有关。而iDC及CCK-8作用的iDC对Treg细胞的功能则无影响。
　　第三部分 八肽胆囊收缩素在cDC调节Treg细胞功能中的作用机制
　　目的:本部分研究应用anti-CD80/CD86和anti-GITR-L观察CCK-8诱导的tDC调节的Treg细胞功能的变化，从而证实CCK-8是否通过调节DC表达的CD80/CD86和GITR-L进而对Treg细胞的功能产生影响。同时探讨CCK-8在cDC调节Treg细胞功能中的受体机制。
　　方法:1.CD80、CD86和GITR-L对CCK-8诱导的tDC调节Treg细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。
　　2.CD80、CD86和GITR-L在CCK-8诱导的tDC调节Treg增殖中的作用。
　　3.CD80、CD86和GITR-L对CCK-8诱导的tDC调节Treg抑制效应T细胞增殖能力的影响。
　　4.CCK-8诱导tDC表达CD80、CD86和GITR-L的受体学作用。
　　5.CCK-8诱导的tDC调节Treg细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的受体学作用。
　　6.CCK-8诱导的tDC调节Treg增殖的受体作用:按上述条件培养的DC与CFSE染色的Treg细胞共培养，5天后，收集细胞，流式细胞仪检测Treg细胞增殖情况。
　　7.CCK-8诱导的tDC调节Treg抑制效应T细胞增殖能力的受体作用。
　　8.CCK-8对DC成熟活化过程中PKA/PKC活性的影响。
　　结论:本实验结果提示:anti-CD80/CD86和anti-GITR-L的应用进一步确定了CCK-8在DC调节Treg细胞功能中CD80、CD86和GITR-L发挥的调节作用。CCK-8通过抑制DC表达的CD80/CD86和GITR-L进而促进Treg细胞的功能。CCK-8通过CCK2R抑制mDC表达共刺激分子CD80、CD86和GITR-L，进而对Treg细胞的功能发挥调节作用。CCK-8受体后PKA和PKC通路参与CCK-8调节DC的作用，进而对Treg细胞的功能发挥了调节作用。
　　第四部分 八肽胆囊收缩素在PGE2调节的Treg细胞分化中的作用
　　目的:外源性给予PGE2，观察其对人外周血初始CD4+T细胞分化为Treg细胞的调节作用机制以及CCK-8在PGE2对Treg细胞分化和功能中的调节作用，以其进一步揭示CCK-8在免疫系统中发挥的免疫抗炎调节作用。
　　方法:1.EP受体在PGE2抑制Treg细胞分化中的作用。
　　2.PGE2对诱导分化的Treg细胞中cAMP含量和PKA活性的影响。
　　3.cAMP-PKA通路在PGE2抑制Treg细胞分化及其功能中的作用。
　　4.CCK-8在PGE2抑制Treg细胞分化及其功能中的作用。
　　结果:1.Butaprost和L-902，688降低了CD25+Foxp3+细胞的数量和Foxp3mRNA的表达，但是Sulprostone没有任何作用，AH6809和GW627368X均翻转了PGE2引起的Treg细胞数量和Foxp3mRNA表达的下降。
　　2.PGE2可明显诱导cAMP生成增多和PKA活性增高，Butaprost和L-902，688模拟了PGE2的作用，db-cAMP作为阳性对照，具有相似的作用，该结果被EP2和EP4拮抗剂翻转，AH6809和GW627368X阻断了PGE2的作用。
　　3.db-cAMP模拟了PGE2在Treg细胞分化中的作用，它降低，Treg细胞的数量和Foxp3 mRNA的表达，同时降低Foxp3+CTLA-4+细胞和Foxp3+GITR+细胞的数量，抑制IL-10的生成。而H-89翻转了PGE2对Treg细胞分化和功能的抑制作用，阻断了Butaprost和L-902，688对Treg细胞数量和Foxp3 mRNA表达以及CTLA-4和GITR的表达、IL-10的分泌的影响。
　　4.CCK-8单独作用于Treg细胞，可以上调Treg细胞数量，促进Foxp3mRNA的表达，上调CTLA-4和GITR的表达以及IL-10的分泌，但是仅部分逆转PGE2抑制的Treg细胞分化及CTLA-4和GITR的表达以及IL-10的分泌，并不能完全逆转。
　　结论:以上结果证明PGE2通过EP2/EP4受体和cAMP/PKA通路抑制人初始CD4+T细胞分化为Treg细胞以及Treg细胞CTLA-4和GITR的表达和IL-10的分泌。而CCK-8部分拮抗了PGE2对Treg细胞分化和功能的抑制作用。
　　结论:本研究使用磁珠分选健康人外周血来源的CD14+单核细胞，体外诱导其分化为iDC和mDC，检测CCK-8对两种状态的DC表型成熟的影响，进而观察了CCK-8调节的DC在Treg细胞功能中的影响，并探索CD80、CD86和GITR-L在DC调节Treg功能中作用以及CCK-8的受体作用机制，得出以下结论:
　　1.本实验证实，CCK-8抑制mDC表型，诱导半成熟状态的DC即tDC的生成。CCK-8既可以上调mDC调节的Treg细胞的抑制功能，又可以促进mDC调节的Treg细胞增殖，此作用可能与其诱导tDC的生成有关。
　　2.CCK-8可能通过调节DC表达的CD80/CD86和GITR-L进而对Treg细胞的功能产生影响。CCK-8通过CCK2R抑制mDC表达CD80、CD86和GITR-L，进而对Treg细胞的功能发挥调节作用。CCK-8受体后PKA和PKC通路参与CCK-8调节DC的作用，进而对Treg细胞的功能发挥了调节作用。
　　3.PGE2通过EP2/EP4受体和cAMP/PKA通路抑制人初始CD4+T细胞分化为Treg细胞以及Treg细胞CTLA-4和GITR的表达和IL-10的分泌。而CCK-8部分拮抗了PGE2对Treg细胞分化和功能的抑制作用。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 八肽胆囊收缩素对人外周血cDC表型的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 八肽胆囊收缩素对cDC调节Treg细胞功能的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 八肽胆囊收缩素在cDC调节Treg细胞功能中的作用机制

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分 八肽胆囊收缩素在PGE2调节的Treg细胞分化中的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 调节性T细胞在免疫调节中的作用

致谢

个人简历