喷他佐辛对高糖环境下体外培养视网膜Müller细胞中的GDNF、BDNF表达和分泌的影响

摘要

目的：通过体外建立糖尿病视网膜病变（Diabeticretinopathy，DR）视网膜Müller细胞的病理模型，给予sigma-1受体(sigma-1receptor,σR1)特异性配体喷他佐辛干预，观察高糖环境下视网膜Müller细胞中表达及分泌胶质源性神经营养因子（Glialderivedneurotrophicfactor，GDNF）和脑源性神经营养因子（Brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）的变化，探讨喷他佐辛对高糖环境中视网膜Müller细胞表达及分泌GDNF和BDNF的影响,为喷他佐辛对DRMüller细胞的作用机制提供新的理论基础。
　　方法：通过体外分离新生3-5天的SD大鼠乳鼠视网膜细胞，采用组织块培养法，原代培养SD大鼠乳鼠视网膜Müller细胞，8-12天后体外培养的视网膜Müller细胞90％以上融合，按1:2的比例进行传代，传到第3代时，经免疫细胞化学法鉴定，确定所培养的细胞为视网膜Müller细胞后，饥饿处理细胞，同时给予高糖、喷他佐辛药物干预，将实验分4组：正常对照组(葡萄糖浓度为5mmol/L,NC),高糖组(葡萄糖浓度为30mmol/L,G),喷他佐辛组(喷他佐辛浓度为3umol/L,P),高糖+喷他佐辛组(葡萄糖浓度为30mmol/L,喷他佐辛浓度为3umol/L,GP),经喷他佐辛药物干预24h、72h和120h后，分别通过免疫印迹（WestenBlot）法和酶联免疫吸附实验（ELISA）法，测定视网膜Müller细胞内及视网膜Müller细胞培养上清液中GDNF和BDNF的表达水平。
　　应用SPSS17.0软件对所有实验数据进行分析，计数资料采用卡方检验；计量资料采用均数±标准差表示；均数间比较采用单因素方差分析；以P＜0.05为差异具有统计学意义。
　　结果：1、视网膜Müller细胞的鉴定：通过免疫细胞化学法鉴定所培养的视网膜细胞为视网膜Müller细胞；2、WestenBlot法测定视网膜Müller细胞内GDNF和BDNF蛋白表达水平：2.1喷他佐辛干预24h、72h和120h后视网膜Müller细胞内GDNF的表达情况：1）高糖干预24h后，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为：0.792±0.010、0.956±0.007、1.073±0.022、1.082±0.022，高糖组与正常组比较,GDNF在视网膜Müller细胞内的表达明显升高（P＜0.05）。同一时间点给予喷他佐辛干预后，喷他佐辛组与正常组比较，GDNF的表达水平也升高（P＜0.05）,而高糖+喷他佐辛组与高糖组比较，GDNF的表达水平无明显差异（P＞0.05）,高糖+喷他佐辛组与正常组比较，GDNF的表达水平明显升高（P＜0.05）。2）喷他佐辛干预72h后，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为：0.507±0.007、0.729±0.002、0.851±0.003、1.094±0.016；干预120h后，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为：0.638±0.003、0.915±0.003、1.127±0.001、1.206±0.027，高糖组、喷他佐辛组和高糖+喷他佐辛组与正常组分别比较、高糖+喷他佐辛组与高糖组比较GDNF的表达水平显著升高，均有统计学意义(P＜0.05)。2.2喷他佐辛干预24h、72h和120h后视网膜Müller细胞内BDNF的表达情况：1）喷他佐辛干预24h后，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为：1.059±0.006、0.936±0.001、1.051±0.006、0.940±0.004，高糖组与正常组比较，BDNF在视网膜Müller细胞内的表达减少（P＜0.05）。高糖+喷他佐辛组与正常组比较，BDNF的表达水平减少（P＜0.05）。喷他佐辛组与正常组比较、高糖+喷他佐辛组与高糖组比较，BDNF的表达水平均没有明显变化（P＞0.05）。2）喷他佐辛干预72h后，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为：0.948±0.029、0.795±0.007、1.111±0.025、0.999±0.014，高糖组与正常组比较，BDNF在高糖组的表达量明显减少（P＜0.05），而在同一时间点的喷他佐辛干预后，喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组与正常组比较、高糖+喷他佐辛组与高糖组比较，BDNF的表达明显升高（P＜0.05）；干预120h后，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为：0.774±0.002、0.629±0.004、0.867±0.001、0.755±0.006，高糖组与正常组比较，BDNF在高糖组的表达水平明显减少（P＜0.05），而在同一时间点的喷他佐辛干预后，喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组与正常组比较、高糖+喷他佐辛组与高糖组比较，BDNF的表达明显升高（P＜0.05）。3、ELISA测定视网膜Müller细胞培养基上清液中GDNF和BDNF的表达：1）喷他佐辛干预24h、72h和120h后上清液中GDNF表达水平的比较：干预24h时，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为：2.767±0.279、1.966±0.315、3.096±0.232、2.599±0.305；干预72h时，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为：2.334±0.261、1.674±0.341、2.852±0.419、2.228±0.240；干预120h时，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中GDNF的表达量分别为：2.187±0.250、1.443±0.356、2.539±0.321、2.074±0.256。高糖干预24h、72h和120h后，高糖组与正常组比较，上清液中GDNF的表达水平均明显减少（P＜0.05）。而在同一时间点给予喷他佐辛干预的各组中，喷他佐辛组与正常组比较、喷他佐辛+高糖组与高糖组比较，发现培养上清液中GDNF的表达显著增加（P＜0.01），喷他佐辛+高糖组与正常组比较，培养上清液中GDNF的表达水平没有显著差异（P＞0.05）。2）喷他佐辛干预24h、72h和120h后上清液中BDNF表达水平的比较：干预24h时，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为：6.670±0.224、5.114±0.260、6.278±0.137、4.689±0.251；干预72h时，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为：6.172±0.260、4.637±0.256、3.574±0.219、2.597±0.139；干预120h时，正常对照组、高糖组、喷他佐辛组、高糖+喷他佐辛组中BDNF的表达量分别为：5.433±0.254、3.939±0.250、2.903±0.213、1.951±0.136。高糖干预24h、72h和120h后，高糖组与正常组比较，上清液中BDNF的表达水平均显著减少（P＜0.01），而在同一时间点给予喷他佐辛干预后，喷他佐辛组、喷他佐辛+高糖组与正常组比较、喷他佐辛+高糖组与高糖组比较，发现BDNF的表达水平也显著减少（P＜0.01）。
　　结论：
　　1、高糖环境下,视网膜Müller细胞表达GDNF水平升高和分泌GDNF水平下降，应用喷他佐辛可上调GDNF的表达和分泌。
　　2、高糖环境下，视网膜Müller细胞表达及分泌BDNF水平明显减少，应用喷他佐辛后可逆转视网膜Müller细胞中BDNF表达减少的现象，但并没有改变视网膜Müller细胞分泌BDNF减少的情况，反而抑制了视网膜Müller细胞对BDNF的分泌。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1实验动物

2实验细胞

3试剂和仪器

4 SD大鼠乳鼠视网膜Müller细胞原代培养

5 ELISA测定视网膜Müller细胞培养基上清液中GDNF和BDNF的表达

结果

1视网膜Müller细胞的形态及鉴定

2 Westen Blot测定视网膜Müller细胞内GDNF和BDNF表达水平的结果

3 ELISA检测培养上清液中GDNF和BDNF的蛋白水平

附图

附表

讨论

1高糖促进视网膜Müller细胞中GDNF的表达

2高糖抑制视网膜Müller细胞中GDNF的分泌

3喷他佐辛促进视网膜Müller细胞中GDNF的表达和分泌

4高糖抑制视网膜Müller细胞中BDNF的表达及分泌

5喷他佐辛上调视网膜Müller细胞中BDNF的表达

6喷他佐辛抑制视网膜Müller细胞分泌BDNF

结论

参考文献

综述: σR1对视网膜保护作用的研究进展

致谢

个人简历