姜黄素化合物对急性高脂血症大鼠肝脏脂代谢的影响及其作用机制

摘要

目的：随着人们生活方式及饮食结构的显著改变，高脂血症（Hyperglipemia，HLP）已经成为我国重要的公共健康问题。调查显示，目前我国18岁及以上成人的血脂异常患病率已高达18.6％，其中高甘油三脂血症患病率11.9%，明显高于胆固醇血症患病率2.9%及低高密度脂蛋白血症7.4%等类型[1]。众所周知，肝脏是人体脂肪代谢的重要器官，涉及脂肪的合成、分解、转运等过程。而肝脏的脂代谢失衡，将会逐渐引起脂肪在肝脏的大量聚集并沉积，最终导致出现非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD），NAFLD与糖尿病和肥胖关系密切，近二十年间，NAFLD的患病率增加了一倍，成为西方国家头号肝病[2]。NAFLD包括非酒精性单纯性脂肪肝（ nonalcoholic fatty liver， NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholicsteatohepatitis，NASH）甚至肝硬化和肝细胞癌（ hepatocellular carcinoma，HCC）。肝脏脂质代谢过程非常复杂，而脂肪酸的β氧化是脂肪分解的重要形式。肉毒碱棕榈酰基转移酶（camitine palmitoyltransferase，CTP-1A）是脂肪酸β氧化过程中的重要限速酶，CTP-1A的水平变化与高脂血症的发生关系密切。过氧化物酶体增殖物激活受体-α（peroxisome proliferativeactivated receptor-α， PPAR-α）是脂肪酸氧化过程中的上游转录因子,CTP-1A是其下游的关键靶基因，CTP-1A的表达变化受PPAR-α的调控[3]。PPAR-α/CTP-1A通路是肝脏脂代谢的重要通路。姜黄素是我们从植物姜黄的根茎中提取出的一种天然多酚类物质，具有降血脂、改善脂代谢、抗氧化、抗炎镇痛、抗肿瘤等多种作用。降脂通络软胶囊（神威药业）是以姜黄素化合物为主要原料制成的软胶囊，是临床应用的一种降脂中成药，但其降低血脂的具体机制是否与肝脏PPAR-α/CTP-1A通路有关，目前尚不清楚。本实验通过蛋黄乳剂法建立大鼠急性高脂血症模型，观察急性高脂状态下SD大鼠肝脏脂肪沉积情况、脂代谢相关酶类的变化，明确姜黄素化合物是否可以通过PPAR-α/CPT-1A信号途径促进脂肪氧化从而改善肝脏脂代谢，探讨其降脂机制和可能的肝脏保护作用，为临床提供理论依据并指导临床用药。
　　方法：
　　1.实验对象及分组：健康雄性SD大鼠48只（月龄5-6周，体质量180±20g），随机分为正常对照组、高脂模型组、姜黄素化合物低剂量组(姜黄素化合物溶液125mg/kg.d)、姜黄素化合物中剂量组(姜黄素化合物溶液250mg/kg.d)、姜黄素化合物高剂量组（姜黄素化合物溶液500mg/kg.d）、非诺贝特组（非诺贝特30mg/kg.d）6组。正常对照组、高脂模型组给予西王玉米油(2.5ml/kg.d)灌胃，实验组分别给予相应上述药物灌胃，均于每日同一时间进行灌胃1次，共干预10天。
　　2.急性高脂血症大鼠模型的制备：第10天灌胃1小时后，分别给予高脂模型组、实验组大鼠一次性腹腔注射75%新鲜蛋黄乳液25ml/kg制备急性高脂模型；给予正常对照组大鼠生理盐水25ml/kg腹腔注射。
　　3.标本制备及检测指标：腹腔注射24小时后断尾取血(取血前10小时禁食水)，全自动化学分析法测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C），采用试剂盒检测SD大鼠血清及其肝脏游离脂肪酸（FFA）、肝脏TG的含量。取血后给予4%水合氯醛(10ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，无菌环境下开腹取出肝脏，部分肝组织用于冰冻切片，进行HE染色及油红O染色观察其肝脏结构变化及脂肪变程度；剩余部分肝组织立即液氮速冻，-80℃冰箱保存用于测定PPAR-α、CPT-1A mRNA及蛋白含量。
　　4.统计学分析：所有数据均采用SPSS13.0软件包进行统计分析，计量资料结果使用均数±标准差(?x±s)来表示，各组间比较采用单因素方差分析。多重比较则应用LSD、SNK-q检验分析。P<0.05则认为差异具有统计学意义。
　　结果：
　　1.证实急性高脂模型成立：腹腔注射蛋黄乳液6小时后血TG（9.66±10.98mmol/L），TC（8.72±2.17mmol/L）, LDL-C（0.78±0.57mmol/L）水平开始升高。至24小时 TG（20.97±15.85mmol/L）， TC（10.34±4.24mmol/L）, LDL-C（0.58±0.25mmol/L）达高峰， HDL-C（2.49±0.88mmol/L）较前降低，与0h时比较差异具有统计学意义（P＜0.05），证实SD大鼠急性高脂血症模型造模成功；
　　2.各组大鼠血脂、血清游离脂肪酸水平比较：急性高脂模型组大鼠血脂及血清FFA的水平均明显高于正常对照组（P＜0.01）；与急性高脂模型组比较，姜黄素化合物各剂量组及非诺贝特组均可显著降低大鼠血清TG、TC、LDL-C以及FFA水平（P＜0.05），且升高血HDL-C水平（P＜0.05），各组中尤以姜黄素高剂量组作用最为明显；非诺贝特组及姜黄素中剂量组降低血脂及FFA作用次之，但非诺贝特组和姜黄素中剂量组之间比较差异不明显（P＞0.05）;
　　3.各组大鼠肝脏甘油三酯、游离脂肪酸含量比较：急性高脂模型组大鼠肝脏TG、FFA含量明显高于正常对照组（P＜0.01）；姜黄素化合物各剂量组能够明显降低大鼠肝脏TG、FFA含量（P＜0.05），且上述作用具有显著的药物剂量依赖性；非诺贝特组也可明显降低大鼠肝脏TG、FFA的含量（P＜0.05），但与姜黄素中剂量组间比较差异不明显（P＞0.05）；4各组大鼠肝功水平比较：各组大鼠血ALT、AST水平均无统计学差异（P＞0.05）；
　　5.各组大鼠肝脏组织光镜结果比较：
　　5.1. HE染色：正常对照组大鼠肝脏细胞的结构清晰完整，排列整齐一致，胞浆呈均匀红染；急性高脂模型组肝细胞肿胀显著、透明变性，结构紊乱，局部细胞溶解，其内可见大小不等、数量不一的小空泡；姜黄素化合物低、中、高剂量组随药物剂量的增加，肝细胞肿胀程度较模型组逐渐减轻，细胞排列较整齐，胞内空泡数量逐渐减少，其中高剂量组改变最为显著，仅可见肝细胞轻度水肿，细胞排列整齐；非诺贝特组肝细胞轻度水样变，结构稍紊乱;
　　5.2.油红O染色：正常对照组肝细胞结构完整，胞浆淡蓝色，未见红色脂滴；急性高脂模型组肝细胞内可见少量微小的红色类圆形脂滴，未见明显的脂质聚集、沉积；各药物干预组肝细胞内的红色脂滴均有不同程度地减少，且此作用呈药物剂量依赖性，其中姜黄素化合物高剂量组改变最显著，细胞内未见脂滴存在；
　　6.姜黄素化合物对脂代谢通路中脂酸β氧化关键酶CPT-1A的影响：
　　6.1.各组大鼠肝脏CPT-1A mRNA表达水平的比较：急性高脂模型组大鼠肝脏中CPT-1A mRNA的表达水平较正常对照组显著下降（P＜0.01）；姜黄素化合物低、中、高剂量组CPT-1A mRNA表达水平较急性高脂模型组均显著升高（P＜0.01），且具有剂量依赖性；非诺贝特组CPT-1A mRNA表达水平较急性高脂模型组亦升高（P＜0.01），但与姜黄素中剂量组间差异不明显（P＞0.05）;
　　6.2.各组大鼠肝脏CPT-1A的蛋白表达水平比较：急性高脂模型组大鼠肝脏中CPT-1A蛋白表达量较正常对照组显著下降（P＜0.01）；姜黄素化合物低、中、高剂量组CPT-1A蛋白表达量较急性高脂模型组均显著升高（P＜0.01），且具有剂量依赖性；非诺贝特组CPT-1A蛋白表达量较急性高脂模型组亦升高（P＜0.01），但与姜黄素中剂量组间差异不明显（P＞0.05）；
　　7.姜黄素化合物对PPAR-α的影响：急性高脂模型组大鼠肝脏中PPAR-αmRNA和蛋白的表达水平较正常对照组显著下降（P＜0.01）；姜黄素化合物低、中、高剂量组PPAR-αmRNA和蛋白表达水平较急性高脂模型组均显著升高（P＜0.01），且具有剂量依赖性；非诺贝特组PPAR-αmRNA和蛋白表达水平较急性高脂模型组亦升高（P＜0.01），但与姜黄素中剂量组间差异不明显（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.一次性腹腔注射75%蛋黄乳液成功制备大鼠急性高脂血症模型，表现为注射24h后血TG、TC、LDL-C水平达高峰，血FFA升高，并且肝脏结构开始紊乱，可见轻度脂质沉积，但转氨酶水平较正常组无明显差异。
　　2.姜黄素化合物低、中、高剂量组和非诺贝特组可不同程度地改善急性高脂大鼠的血脂异常，并且降低血清FFA及肝脏FFA、TG的水平，减轻肝细胞损伤程度及脂肪沉积，且姜黄素高剂量组作用最为显著。
　　3.急性高脂可抑制大鼠肝脏调控脂肪酸β氧化途径 PPAR-α/CPT-1A表达；姜黄素化合物低、中、高剂量组和非诺贝特组可不同程度地激活PPAR-α/CPT-1A表达，促进脂肪酸β氧化；且姜黄素高剂量组效果最为显著。

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中文摘要

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英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

3 标本的采集

4 标本的检测

5 统计学分析

结果

1 证实急性高脂模型成立

2 各组大鼠血脂、血清游离脂肪酸水平比较

3 各组大鼠肝脏游离脂肪酸、甘油三酯含量比较

4 各组大鼠肝功水平比较

5 各组大鼠肝脏组织光镜结果比较

6 姜黄素化合物对脂代谢通路中脂酸β氧化关键酶CPT-1A的影响

7 姜黄素化合物对调控脂酸β氧化途径的上游转录因子PPAR-α的影响

附图

附表

讨论

1 制备急性高脂血症动物模型

2 肝脏脂代谢

3 姜黄素的降脂作用

结论

参考文献

综述: PPAR-α对非酒精性脂肪肝的影响

致谢

个人简历