化瘀通络中药及其拆方对糖尿病肾病大鼠的干预作用及对裂孔膜蛋白Nephrin和NEPH1的影响

摘要

目的：糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）常见的微血管并发症之一，也是糖尿病患者致残、致死的重要原因。本研究旨在观察化瘀通络中药及其拆方对DN大鼠的干预作用及对裂孔膜蛋白Nephrin、NEPH1水平的影响，探讨其可能的作用机制，并比较化瘀通络中药及其拆方的作用差别，为临床防治 DN提供实验依据。
　　方法：健康雄性SD大鼠80只，体重100g±10g，适应性喂养1周后，随机分为正常对照组（C组）10只，造模组70只。C组大鼠予普通饲料喂养，造模组大鼠予高糖高脂饲料喂养。4周后，造模组大鼠予链脲佐菌素（STZ）溶液（35mg/kg）腹腔注射，C组注射相应体积枸橼酸缓冲液。72小时后随机血糖≥16.7mmol/L为DM造模成功。将成模大鼠随机分为模型组（M组）、化瘀通络组（Q组）、化瘀组（H组）、通络组（T组）、厄贝沙坦组（I组）。各治疗组分别给予相应药物灌胃， C组、M组灌服相应体积蒸馏水，连续干预16周。于16周末收集24小时尿液，检测24小时尿蛋白定量；麻醉状态下腹主动脉取血检测血液指标；留取肾组织，应用光镜、电镜观察大鼠肾脏病理改变；采用免疫组化、Western Blot、Real-time PCR方法检测足细胞裂孔膜蛋白Nephrin、NEPH1的表达水平。
　　结果：
　　1.实验大鼠的一般情况:C组大鼠一般情况良好；与C组比较，造模大鼠逐渐出现多食、多饮、多尿及体重减轻表现，其中以 M组尤甚，各给药组大鼠在治疗过程中诸症均有不同程度缓解。
　　2肾重、体重及肾脏肥大指数:大鼠肾重各组间无统计学差异。与 C组相比，M组大鼠体重减轻，肾脏肥大指数升高，有统计学差异；与M组比较，各治疗组体重、肾脏肥大指数无统计学差异。
　　3.24小时尿蛋白定量（24hUTP）:与C组比较，M组大鼠24hUTP明显增多；与M组比较，各治疗组24hUTP明显减少；各治疗组相比，Q组与I组比较24hUTP无明显差异，Q组24hUTP少于H、T组。
　　4.空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）:与C组比较，造模各组FBG均明显升高；造模各组间FBG无统计学差异。与C组比较，M组大鼠TC、TG均明显升高；各治疗组大鼠较M组，TC、TG明显降低；各治疗组比较，TC无统计学差异，Q组TG少于H、T、I组。
　　5.总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血肌酐（Scr）:大鼠TP、ALB水平组间无明显差异。与C组比较，M组大鼠Scr水平明显升高；与M组比较，Q组Scr水平下降，I、H、T组与M组比较无差异。
　　6.血浆凝血酶原时间（PT）:与C组比较，M组PT明显降低；与M组比较，Q组PT显著延长，I、H、T组与M组比较无差异。
　　7.肾脏病理形态学观察
　　7.1光镜观察:C组大鼠肾小球结构正常；M组大鼠肾小球肥大，部分肾小囊腔变窄，系膜基质增多，基底膜增厚；与M组相比，各治疗组病理改变明显减轻， H组病理表现略重于其它治疗组。
　　7.2电镜观察:C组大鼠肾小球超微结构基本正常；M组大鼠肾小球基底膜均质性增厚，系膜基质增多，足突融合；与 M组比较，各治疗组病理改变明显减轻，H组病理表现略重于其它治疗组。
　　8.免疫组织化学法检测肾组织Nephrin、NEPH1的表达。结果显示：Nephrin、NEPH1两种蛋白主要表达于肾小球。与C组相比，各造模组大鼠Nephrin、NEPH1表达减少；与M组相比，各治疗组Nephrin、NEPH1表达增多。
　　9.Western Blot检测肾组织Nephrin、NEPH1的表达。与C组比较，M组大鼠Nephrin、NEPH1蛋白表达均明显下降；与M组比较，Q、I、T组Nephrin、NEPH1蛋白表达增加， H组与M组相比无明显差异；各治疗组相比，NEPH1蛋白表达未见明显差异，Q组Nephrin蛋白表达高于H、T、I组。
　　10.Real-time PCR检测肾组织Nephrin、NEPH1 mRNA的表达。与C组比较，M组大鼠Nephrin、NEPH1mRNA表达明显下降；与M组比较，各治疗组Nephrin、NEPH1mRNA表达增加；各治疗组相比，NEPH1 mRNA表达未见明显差异，Q、T、I组Nephrin mRNA表达量较高，与H组有统计学差异。
　　结论：
　　1.化瘀通络中药可以改善DN大鼠一般情况、减少尿蛋白、降低DN大鼠总胆固醇及甘油三酯水平、降低血肌酐、延长凝血酶原时间、减轻DN肾脏病理损伤，具有肾保护作用。
　　2.化瘀通络中药可能通过上调Nephrin、NEPH1表达水平，而部分修复足细胞，减少尿蛋白，发挥肾保护作用。
　　3.裂孔膜蛋白Nephrin与NEPH1在糖尿病肾病大鼠肾组织内同步表达，提示二者在结构与功能上存在某种密切联系。
　　4.化瘀通络中药全方配伍合理，效果最佳；拆方比较，化瘀中药与通络中药在DN保护作用方面可能存在协同作用，且通络中药效果优于化瘀中药。

目录

封面

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中文摘要

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前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 实验大鼠的一般情况

2 各组大鼠肾重、体重及肾脏肥大指数（HI，肾重/体重）比较

3 各组大鼠24小时尿蛋白定量（24h UTP）比较

4 各组大鼠空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）比较

5 各组大鼠总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、血肌酐（Scr）比较

6 各组大鼠血浆凝血酶原时间（PT）比较

7 肾脏病理形态学观察

8 免疫组化检测肾组织Nephrin、NEPH1的表达

9 Western Blot检测肾组织Nephrin、NEPH1的表达

10 Real-time PCR检测肾组织Nephrin、NEPH1 mRNA的表达

附图

附表

讨论

1 中医对糖尿病肾病的认识

2 方药分析

3 化瘀通络中药对DN的干预作用

结论

参考文献

综述:Nephrin相关信号通路的研究进展

致谢

个人简历