髓系细胞高表达TL1A在实验性小鼠肝纤维化发生和逆转过程中作用的研究

摘要

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病向肝硬化发展过程中的必经阶段，是各种病因导致炎症、坏死等组织损伤的修复反应。若肝纤维化进程得不到阻抑或逆转则可能进展为失代偿期肝硬化，并出现各种终末期肝病并发症，严重影响患者生存质量和预后。但目前肝纤维化的治疗效果不甚理想，尚乏有效治疗手段。因此，对肝纤维化的深入研究极具必要性和重要意义。
　　肝纤维化的病理特征是细胞外间质（extracellular matrix, ECM）的过量沉积。肝脏内多种细胞以不同形式参与肝纤维化形成，其中肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）的活化、增殖，产生大量ECM是肝纤维化发生的关键环节。巨噬细胞是机体重要的固有免疫细胞，主要通过吞噬作用清除病原体和异物，并介导炎症反应。此外，巨噬细胞还具有免疫调节和抗原递呈功能。既往研究证实在肝纤维化发生阶段持续的损伤刺激可诱导巨噬细胞向肝脏募集并分泌大量具有促炎、促纤维化功能的细胞因子，通过促进HSCs活化和增殖参与肝纤维化进程，在该过程中通过减少巨噬细胞向肝脏募集或抑制其功能均能减轻肝纤维化程度。然而，在肝纤维化恢复阶段巨噬细胞发挥截然相反的作用，主要通过分泌一系列基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）加速ECM降解，在此过程中减少巨噬细胞募集可显著阻止肝纤维化恢复。因此，深入研究巨噬细胞功能及其作用机制可能为临床中肝纤维化的治疗提供新思路。
　　肿瘤坏死因子样配体1A（TNF-like ligand1 aberrance, TL1A）又称为血管内皮细胞生长抑制因子（vascular endothelial growth inhibitor, VEGI），是新近发现的一种肿瘤坏死因子家族新成员，主要有促进炎症反应和抑制血管生成两方面作用。对TL1A促进炎症反应的研究主要集中在自身免疫性疾病领域，如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）等。其中，在硫酸葡聚糖（dextran sulfate sodium， DSS）诱导的实验性小鼠结肠炎模型中发现髓系单核细胞（巨噬细胞和树突状细胞）高表达TL1A的转基因小鼠与野生型小鼠相比肠纤维化程度更重，而应用TL1A抗体干预可减轻肠道炎症和纤维化，从而证实TL1A参与肠纤维化发生。近期在原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis, PBC）的临床研究中发现，PBC患者血清和肝组织中TL1A表达显著高于正常人群，并进一步在肝组织枯否细胞和浸润的单核细胞中发现TL1A表达增加，提示TL1A可能参与肝纤维化发生。
　　TL1A与血管生成的研究主要集中在肿瘤领域。业已证实，TL1A通过抑制血管生成抑制肿瘤生长和肿瘤细胞远处转移。血管生成在肝纤维化发生和逆转阶段发挥截然相反的作用。在肝纤维化发生时，肝细胞水肿、炎症坏死造成局部组织缺氧促进新生血管生成，有助于炎细胞浸润和炎症反应发生，从而加重肝纤维化，在此过程中通过抑制血管生成可减轻肝纤维化程度。近期研究发现，血管生成利于巨噬细胞向肝脏募集，在肝纤维化逆转阶段促进ECM降解。但目前尚无TL1A及其相关的血管改变在肝纤维化逆转中的研究。
　　本实验通过 CCl4腹腔注射构建肝纤维化模型及其自发逆转模型，利用髓系细胞高表达TL1A的转基因小鼠和野生型小鼠作对比，探讨髓系细胞高表达TL1A在肝纤维化发生和逆转中的作用。提取两种小鼠的骨髓来源巨噬细胞和腹腔巨噬细胞，研究 TL1A对巨噬细胞分泌细胞因子的影响。进一步收集巨噬细胞上清液干预小鼠原代HSCs，探讨TL1A高表达巨噬细胞在HSCs胶原代谢中的作用。实验内容主要包括以下三部分：第一部分髓系细胞高表达TL1A对实验性小鼠肝纤维化发生的影响
　　目的：探讨髓系细胞（巨噬细胞和树突状细胞）高表达TL1A对CCl4诱导的小鼠肝损伤和肝纤维化程度的影响。
　　方法：将髓系细胞高表达 TL1A的转基因小鼠（ FMS-TL1A-GFP-transgenic, M-Tg）与有相同遗传背景的C57BL/6野生型（wild type, WT）小鼠（6~8周）随机分为Control/WT组、Oil/WT组、CCl4/WT组、Control/Tg组、Oil/Tg组及CCl4/Tg组，每组10只。采用腹腔注射10％CCl4橄榄油溶液（5μL·g-1，每周二、五分别给药一次）建立小鼠肝纤维化模型，并设立单纯注射生理盐水和橄榄油作为对照（Control）组和橄榄油溶剂对照（Oil）组。采用F4/80和TL1A免疫荧光双标记法检测TL1A的定位分布，Real-time Q-PCR技术和Western blot技术检测TL1A在肝组织中的定量表达；自动生化仪检测小鼠肝功能改变；Haematoxylin and eosin staining（H&E染色）观察肝脏组织病理学改变；末段脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末段标记（ terminal deoxynucleotidy transferrase UTP-nick end labeling, TUNEL）法检测肝细胞凋亡情况；天狼猩红染色方法和羟脯氨酸检测法评估肝纤维化程度；免疫组织化学染色、Real-time Q-PCR技术和Western blot技术检测Collagen1α1和α-SMA表达变化；Real-time Q-PCR技术和Western blot技术检测MMP-2和MMP-9表达变化。
　　结果：1)应用基因FMS-TL1A-GFP特定引物序列扩增小鼠DNA后凝胶成像测定，Tg小鼠目的基因在191 bp位置成像，而WT小鼠在191 bp位置无目的基因表达，据此可以筛选鉴定髓系细胞高表达TL1A的转基因小鼠。2)小鼠肝纤维化模型成功建立：CCl4/WT组肝组织H&E染色可见炎细胞浸润增多、小叶结构紊乱、汇管区扩大；天狼猩红染色显示纤维结缔组织明显增多。3) CCl4/WT组肝组织中TL1A和F4/80免疫荧光共染方法检测到 TL1A表达于巨噬细胞中。检测 TL1A的平均光密度显示， CCl4/WT组中平均光密度值显著高于 Oil/WT组（0.031±0.005 vs0.021±0.003, P<0.01）；CCl4/Tg组显著高于CCl4/WT组（0.053±0.007 vs0.031±0.005, P<0.01）。Real time Q-PCR检测肝组织中TL1A mRNA表达， CCl4/WT组中 TL1A mRNA的相对表达量（3.57±0.81）显著高于Control/WT组（1±0.02）和 Oil/WT组（1.29±0.31），P<0.01；CCl4/Tg组的 TL1A mRNA相对表达量（11.5±1.87）显著高于 Control/Tg组（6.94±0.71）和Oil/Tg组（7.08±1.15），P<0.01；且CCl4/Tg组显著高于CCl4/WT组（11.5±1.87 vs3.57±0.81, P<0.01）。Western blot分析各组TL1A蛋白表达， CCl4/WT组中 TL1A蛋白表达量（0.26±0.05）显著高于Control/WT组（0.13±0.02）和Oil/WT组（0.15±0.05）；CCl4/Tg组中TL1A蛋白表达量（0.72±0.08）显著高于 Control/Tg组（0.36±0.04）和 Oil/Tg组（0.38±0.05），P<0.05；且CCl4/Tg组显著高于CCl4/WT组（0.72±0.08 vs0.26±0.05, P<0.01）。4)生化法检测各组肝功能变化，Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组之间ALT、AST和TBIL水平差异均无统计学意义，P>0.05； CCl4/WT组肝功能损伤明显重于 Oil/WT组（ALT：190.4 U/L±10.4 U/L vs8.3 U/L±3.7 U/L, P<0.05；AST：220.5 U/L±19.3 U/L vs58.5 U/L±14.5 U/L, P<0.05；TBIL：6μmol/L±1.07μmol/Lvs2.81μmol/L±0.66μmol/L, P<0.05）；CCl4/Tg组肝功能损伤明显重于CCl4/WT组（ALT：222.4 U/L±5.2 U/L vs190.4 U/L±10.4 U/L, P<0.05；AST：270.8 U/L±19.7 U/L vs220.5 U/L±19.3 U/L, P<0.05；TBIL：9.09μmol/L±0.9μmol/L vs6μmol/L±1.07μmol/L, P<0.05）。5) H&E染色观察肝组织内肝细胞坏死情况，Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组未见肝细胞坏死；CCl4/WT组和CCl4/Tg组可见肝细胞水肿、胞浆疏松化，肝内汇管区炎症细胞浸润增加，汇管区及周围碎屑样坏死。坏死面积统计CCl4/Tg组较CCl4/WT组显著升高（39.5%±5.1%vs25.8%±3.6%, P<0.05）。6) TUNEL法检测肝细胞凋亡情况，Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组每个视野下凋亡细胞的数量分别为4±1、5±2、5±1、4±1，各组间差异无统计学意义；CCl4/WT组比Oil/WT组肝细胞凋亡明显增多（28±5 vs5±2，P<0.01），CCl4/Tg组比CCl4/WT组肝细胞凋亡显著增加（46±6 vs28±5，P<0.01）。7)天狼猩红染色阳性面积百分比在Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和 Oil/Tg组依次为0.24%±0.05%、0.28%±0.08%、0.27%±0.04%、0.26%±0.06%，各组间差异无统计学意义， P>0.05；CCl4/WT组的阳性面积（1.43%±0.21%）明显高于 Oil/WT组， P<0.01；且CCl4/Tg组的阳性面积（1.85%±0.14%）明显高于CCl4/WT组， P<0.01。羟脯氨酸法检测总胶原水平， Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组羟脯氨酸含量依次为83μg/g±5μg/g、89μg/g±7μg/g、86μg/g±8μg/g、92μg/g±10μg/g，各组间差异均无统计学意义， P>0.05；CCl4/WT（130μg/g±10μg/g）组较Oil/WT组羟脯氨酸含量明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组（162μg/g±14μg/g）较CCl4/WT组明显升高， P<0.05。8)免疫组织化学染色、Real time Q-PCR和Western blot方法检测各组Collagen1α1表达，在Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组间Collagen1α1表达差异均无统计学意义，P>0.05；免疫组织化学染色方法检测Collagen1α1阳性面积显示CCl4/WT组（1.26%±0.31%）显著高于Oil/WT组（0.3%±0.13%），P<0.01；CCl4/Tg组的阳性染色面积显著高于CCl4/WT组（2.96%±0.72%vs1.26%±0.31%, P<0.01）。Real time Q-PCR检测肝组织中Collagen1α1 mRNA的表达，CCl4/WT组相对表达量（3.67±0.48）较Oil/WT组（1.24±0.2）明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（5.08±0.72 vs3.67±0.48, P<0.01）；Western blot技术检测各组Collagen1α1蛋白表达，CCl4/WT组（0.85±0.07）较Oil/WT组（0.68±0.08）Collagen1α1蛋白的表达量明显升高, P<0.05；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（1.27±0.08 vs0.85±0.07, P<0.01）。9)免疫组织化学染色、Real time Q-PCR和Western blot方法检测各组α-SMA表达，在Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组间α-SMA表达差异均无统计学意义，P>0.05；免疫组织化学染色方法检测α-SMA蛋白表达， CCl4/WT组阳性染色面积（2.73%±0.68%）显著高于 Oil/WT组（0.34%±0.08%），P<0.01；CCl4/Tg组的阳性染色面积显著高于CCl4/WT组（3.85%±0.65%vs2.73%±0.68%, P<0.05）。Real time Q-PCR检测肝组织中α-SMA mRNA的表达，CCl4/WT组α-SMA mRNA的相对表达量（3.18±1.25）较Oil/WT组（1.17±0.16）明显升高，P<0.05；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（4.6±0.6 vs3.18±1.25, P<0.05）。Western blot技术检测α-SMA蛋白表达， CCl4/WT组（1.35±0.11）较Oil/WT组（1.01±0.08）α-SMA蛋白的表达量明显升高，P<0.05；CCl4/Tg组较 CCl4/WT组明显升高（1.63±0.1 vs1.35±0.11, P<0.01）。10) Real time Q-PCR和Western blot方法检测肝组织中MMP-2的表达，Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组之间均无统计学差异，P>0.05；MMP-2 mRNA的相对表达量在CCl4/WT组（5.3±1.6）较Oil/WT组（1.02±0.23）明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（10.4±2.8 vs5.3±1.6, P<0.01）。MMP-2蛋白表达在CCl4/WT组（1.15±0.11）较Oil/WT组（0.55±0.08）明显升高， P<0.01；CCl4/Tg组较 CCl4/WT组明显升高（1.31±0.06 vs1.15±0.11, P<0.05）。11) Real time Q-PCR和Western blot方法检测肝组织中MMP-9的表达， Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组之间均无统计学差异，P>0.05；MMP-9 mRNA的表达在CCl4/WT组（4.99±1.73）较Oil/WT组（1.08±0.14）明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（9.97±1.97 vs4.99±1.73, P<0.01）。MMP-9蛋白表达在CCl4/WT组（0.51±0.09）较 Oil/WT组（0.22±0.04）明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（0.72±0.12 vs0.51±0.09, P<0.05）。
　　第二部分 TL1A高表达的巨噬细胞参与肝纤维化进程的机制
　　目的：探讨TL1A高表达的巨噬细胞参与肝纤维进程的体内外机制。
　　方法：动物实验分组同第一部分。巨噬细胞功能检测部分，分别提取野生型 C57BL/6小鼠和髓系细胞高表达 TL1A的转基因小鼠骨髓来源巨噬细胞（ bone marrow-derived macrophage, BMMs）和腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages, PMs），分组如下：PMs分组：Control/WT组、LPS+IFN-γ/WT组、Control/Tg组、LPS+IFN-γ/Tg组，其中Control组为提取出 PMs后用含10%胎牛血清的 DMEM细胞培养液培养72 h；LPS+IFN-γ组为提取出PMs后用含100 ng/mL脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）和25 ng/mL干扰素-γ（interferon, IFN-γ）培养72 h；BMMs分组：Control/WT组、M-CSF+LPS+IFN-γ/WT组、Control/Tg组、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg组，首先提取出骨髓造血干细胞，应用含10 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor, M-CSF）的10%胎牛血清DMEM细胞培养基培养9天诱导分化为巨噬细胞，Control组为继续应用上述培养基培养72 h，M-CSF+LPS+IFN-γ组为应用含10 ng/mL M-CSF、100 ng/mL LPS和25 ng/mL IFN-γ的10%胎牛血清DMEM细胞培养基培养72 h。收集上述分组中的巨噬细胞培养基用于细胞因子检测和作为干预HSCs的条件培养基（conditioned medium, CM）。应用原位循环灌流和密度梯度离心技术分离野生型小鼠HSCs，用BMMs和PMs的条件养基干预，实验分组如下。PMs的CM干预HSCs分组：Control组（用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HSCs24 h）；LPS+IFN-γ组（用含40 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%胎牛血清DMEM细胞培养基培养HSCs24 h）；CM/WT组（用含40%野生型小鼠PMs CM的10%胎牛血清DMEM细胞培养基培养HSCs24 h）；CM/Tg组（用含40%转基因小鼠PMs CM的10%胎牛血清DMEM细胞培养基培养HSCs24 h）。BMMs的CM干预HSCs分组：Control组（用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HSCs24 h）；M-CSF+LPS+IFN-γ组（用含4 ng/mL M-CSF、40 ng/mL LPS和10 ng/mL IFN-γ的10%胎牛血清DMEM细胞培养基培养HSCs24 h）；CM/WT组（用含40%野生型小鼠BMMs CM的10%胎牛血清DMEM细胞培养基培养HSCs24 h）；CM/Tg组（用含40%转基因小鼠BMMs CM的10%胎牛血清 DMEM细胞培养基培养 HSCs24 h）。应用免疫组织化学染色和Real time Q-PCR方法检测肝组织中 F4/80表达。Real time Q-PCR和Western blot方法检测肝组织中C-C趋化因子配体2（C–C chemokine ligand2, CCL2）表达。应用ELISA方法检测血清、巨噬细胞培养基，Real time Q-PCR方法检测肝组织中转化生长因子-β1（transforming growth factor beta, TGF-β1）、血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB, PDGF-BB）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）和白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）表达。Real time Q-PCR和Western blot方法检测HSCs中 Collagen1α1、MMP-13和组织基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP-1）表达。
　　结果：1) Real time Q-PCR检测肝组织中F4/80 mRNA的相对表达量， Control/WT组（1±0.12）、Oil/WT组（1.16±0.22）、Control/Tg组（1.23±0.2）和Oil/Tg组（1.3±0.18）之间差异均无统计学意义，P>0.05；CCl4/WT组（3.95±0.9）较Oil/WT组F4/80 mRNA的相对表达量明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（6.3±0.95 vs3.95±0.9, P<0.05）。免疫组织化学染色方法检测各组 F4/80表达，Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和 Oil/Tg组 F4/80阳性染色面积依次为：0.98%±0.23%、1.03%±0.31%、1.02%±0.16%、1%±0.29%，各组间差异均无统计学意义， P>0.05；CCl4/WT组阳性染色面积（3.7%±1.1%）显著高于Oil/WT组， P<0.01；且CCl4/Tg组的阳性染色面积显著高于CCl4/WT组（6.52%±1.74%vs3.7%±1.1%, P<0.01）。2) Real time Q-PCR和Western blot方法检测肝组织中CCL2表达，Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组之间差异均无统计学意义，P>0.05；CCl4/WT组（5.7±1.6）较Oil/WT组（1.17±0.37）CCL2 mRNA的相对表达量明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（10.74±2.87 vs5.7±1.6, P<0.05）。CCL2蛋白在CCl4/WT组（1.25±0.12）较Oil/WT组（0.85±0.07）表达量明显升高， P<0.01；CCl4/Tg组较 CCl4/WT组明显升高（1.81±0.16 vs1.25±0.12, P<0.01）。3)成功提取小鼠骨髓造血干细胞，并诱导分化为巨噬细胞，成功提取并纯化小鼠腹腔巨噬细胞；通过LPS联合IFN-γ促进巨噬细胞活化，从而获得活化的高表达 TL1A巨噬细胞和野生型巨噬细胞。4) ELISA方法检测血清中 TGF-β1含量、Real time Q-PCR检测肝组织中TGF-β1 mRNA的表达，Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组之间差异均无统计学意义，P>0.05；血清TGF-β1含量在CCl4/WT组（184 pg/ml±17.3 pg/ml）较Oil/WT组（89.1 pg/ml±7.4 pg/ml）明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较 CCl4/WT组明显升高（253.6 pg/ml±11.4 pg/ml vs184pg/ml±17.3 pg/ml, P<0.01）。肝组织中TGF-β1 mRNA的表达在CCl4/WT组（3.83±1.23）较 Oil/WT组（1.22±0.33）明显升高，P<0.05；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（6.45±1.35 vs3.83±1.23, P<0.05）。ELISA方法检测 BMMs上清液中 Control/WT组、 Control/Tg组、M-CSF+LPS+IFN-γ/WT组、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg组TGF-β1含量依次为2679.73 pg/ml±167.01 pg/ml、2495.08 pg/ml±264.47 pg/ml、2515.08 pg/ml±164.47 pg/ml、2572.08 pg/ml±216.35 pg/ml，4组间差异均无统计学意义，P>0.05。检测PMs上清液中TGF-β1含量，与BMMs结果趋势一致。5)采用ELISA方法检测血清中PDGF-BB含量、Real time Q-PCR检测肝组织中 PDGF-BB mRNA的表达， Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和 Oil/Tg组之间差异均无统计学意义， P>0.05；血清PDGF-BB含量在CCl4/WT组（2253.2 pg/ml±297.4 pg/ml）较Oil/WT组（601.7 pg/ml±121.7 pg/ml）明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（3008.7 pg/ml±295.9 pg/ml vs2253.2 pg/ml±297.4 pg/ml, P<0.01）。PDGF-BB mRNA的相对表达量在CCl4/WT组（2.04±0.57）较Oil/WT组（1.07±0.14）明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（3.04±0.33 vs2.04±0.57, P<0.01）。ELISA方法检测BMMs培养液上清中PDGF-BB含量，Control/WT组（7838.38 pg/ml±882.11 pg/ml）与Control/Tg组（8320.44 pg/ml±1038.59 pg/ml）相比无明显差异，P>0.05；而 M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg组比 M-CSF+LPS+IFN-γ/WT组明显升高（15447.36 pg/ml±1129.50 pg/ml vs11464.79 pg/ml±1402.97 pg/ml, P<0.01）。检测PMs上清液中PDGF-BB含量，与BMMs结果趋势一致。6)采用ELISA方法检测血清中TNF-α含量、Real time Q-PCR检测肝组织中TNF-αmRNA的表达，Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组之间差异均无统计学意义，P>0.05；TNF-α含量在CCl4/WT组（61.2 pg/ml±11.8 pg/ml）较Oil/WT组（26.9 pg/ml±5.8 pg/ml）明显升高， P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（104 pg/ml±18.4 pg/ml vs61.2 pg/ml±11.8 pg/ml, P<0.01）。TNF-α mRNA的相对表达量在CCl4/WT组（4.97±0.8）较Oil/WT组（1.09±0.4）明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（8.8±2.5 vs4.97±0.8, P<0.05）。应用ELISA方法检测 BMMs上清液中 TNF-α含量， Control/WT组、Control/Tg组、M-CSF+LPS+ IFN-γ/WT组、M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg组依次为182.19 pg/ml±54.74 pg/ml、195.33 pg/ml±45.57 pg/ml、4128.07 pg/ml±331.40 pg/ml、4613.5 pg/ml±238.15 pg/ml，其中Control/Tg组略高于Control/WT组，但差异无统计学意义，P>0.05；M-CSF+LPS+IFN-γ/WT组明显高于Control/WT组，P<0.01；M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg组明显高于M-CSF+LPS+IFN-γ/WT组（4613.5 pg/ml±238.15 pg/ml vs4128.07 pg/ml±331.40 pg/ml, P<0.05）。检测PMs上清液中TNF-α含量，与BMMs结果趋势一致。7)采用ELISA方法检测血清中IL-1β含量、Real time Q-PCR检测肝组织中pro-IL-1β mRNA的表达，Control/WT组、Oil/WT组、Control/Tg组和Oil/Tg组之间差异均无统计学意义，P>0.05；血清中IL-1β含量在CCl4/WT组（43.5 pg/ml±9.1 pg/ml）较Oil/WT组（29.3 pg/ml±4.7 pg/ml）明显升高，P<0.05；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（64.6 pg/ml±11.3 pg/ml vs43.5 pg/ml±9.1 pg/ml, P<0.01）。Pro-IL-1βmRNA的相对表达量在CCl4/WT组（4.89±0.68）较Oil/WT组（1.12±0.4）明显升高，P<0.01；CCl4/Tg组较CCl4/WT组明显升高（5.93±0.55 vs4.89±0.68, P<0.05）。应用ELISA方法检测 BMMs培养液上清中 IL-1β含量， Control/WT组（34.57 pg/ml±3.11 pg/ml）与Control/Tg组（36.62 pg/ml±3.54 pg/ml）相比无显著性差异，P>0.05；而M-CSF+LPS+IFN-γ/Tg组比M-CSF+LPS+IFN-γ/WT组增加明显（121.08 pg/ml±6.68 pg/ml vs94.10 pg/ml±5.19 pg/ml, P<0.01）。检测PMs上清液中IL-1β含量，与BMMs结果趋势一致。8)应用原位灌注、密度梯度离心法分离小鼠原代HSCs，荧光显微镜（波长328 nm）观察可见初分离的小鼠原代HSCs由于富含维生素 A脂滴，呈自发蓝绿色荧光；应用Desmin免疫荧光染色鉴定分离出的HSCs，在倒置荧光显微镜下阳性细胞胞浆内可见绿色荧光，Desmin染色阳性率约93%。9)应用BMMs条件培养基干预原代HSCs24 h后，Real time Q-PCR和Western blot方法检测HSCs中Collagen1α1的表达，M-CSF+LPS+IFN-γ组与Control组之间差异均无统计学意义， P>0.05；CM/WT组（1.88±0.14）较M-CSF+LPS+IFN-γ组（1.06±0.08）Collagen1α1 mRNA的相对表达量明显升高，P<0.01；CM/Tg组中Collagen1α1 mRNA的相对表达量较CM/WT组明显升高（2.65±0.18 vs1.88±0.14, P<0.01）。CM/WT组Collagen1α1蛋白定量（0.74±0.07）较M-CSF+LPS+IFN-γ组（0.53±0.05）明显升高，P<0.01；CM/Tg组Collagen1α1蛋白定量较CM/WT组明显升高（0.96±0.14 vs0.74±0.07, P<0.01）。应用 PMs条件培养基干预后检测 HSCs中Collagen1α1表达趋势与BMMs相一致。10)应用BMMs条件培养基干预原代HSCs24 h后，Real time Q-PCR和Western blot方法检测HSCs中MMP-13的表达，M-CSF+LPS+IFN-γ组与 Control组之间差异均无统计学意义，P>0.05；CM/WT组的MMP-13 mRNA相对表达量（0.84±0.12）明显低于M-CSF+LPS+IFN-γ组（1.03±0.04），P<0.05；CM/Tg组中MMP-13 mRNA的相对表达量（0.77±0.08）与CM/WT组相比差异无统计学意义， P>0.05。CM/WT组中 MMP-13蛋白表达量（0.35±0.06）比M-CSF+LPS+IFN-γ组（0.46±0.03）明显下降，P<0.01；CM/Tg组中MMP-13蛋白表达量（0.37±0.04）与CM/WT组之间差异无统计学意义，P>0.05。应用PMs条件培养基干预后检测HSCs中MMP-13表达，趋势与BMMs相一致。11)应用BMMs条件培养基干预原代HSCs24 h后，Real time Q-PCR和 Western blot方法检测 HSCs中 TIMP-1的表达， M-CSF+LPS+IFN-γ组与 Control组之间差异均无统计学意义，P>0.05；CM/WT组的 TIMP-1 mRNA相对表达量（1.79±0.07）明显高于M-CSF+LPS+IFN-γ组（1.04±0.05），P<0.01；CM/Tg组中TIMP-1 mRNA的相对表达量较CM/WT组明显升高（2.14±0.16 vs1.79±0.07, P<0.01）。CM/WT组中 TIMP-1蛋白表达量（0.62±0.1）比 M-CSF+LPS+IFN-γ组（0.35±0.06）明显升高， P<0.01；CM/Tg组中 TIMP-1蛋白表达量较CM/WT组明显升高（0.85±0.12 vs0.62±0.1, P<0.01）。应用PMs条件培养基干预后检测HSCs中TIMP-1表达，趋势与BMMs相一致。
　　第三部分髓系细胞高表达TL1A在实验性小鼠肝纤维化逆转过程中的作用
　　目的：探讨髓系细胞高表达TL1A对小鼠肝纤维化逆转、血管生成及巨噬细胞募集的影响。
　　方法：将Tg小鼠与WT小鼠随机分为Oil/WT组（每周2次腹腔注射橄榄油溶液5μL·g-1，持续6周）、CCl46 wk/WT组（每周2次腹腔注射10%CCl4橄榄油溶液5μL·g-1，持续6周）、CCl4 Re1 wk/WT组（完成上述肝纤维化造模后停药恢复1周，分组中用Re代替逆转reversion）、CCl4 Re2 wk/WT组（完成上述肝纤维化造模后停药恢复2周）、Oil/Tg组（处理方式同Oil/WT组）、CCl46 wk/Tg组（处理方式同CCl46 wk/WT组）、CCl4 Re1 wk/Tg组（处理方式同CCl4 Re1 wk/WT组）、CCl4 Re2 wk/Tg组（处理方式同CCl4 Re2 wk/WT组），每组各10只。应用天狼猩红染色和羟脯氨酸检测了解纤维组织降解情况；免疫组织化学染色、Real time Q-PCR和Western blot方法检测肝组织Collagen1α1表达；免疫荧光法和 Western blot方法检测血小板内皮细胞粘附分子1（ Platelet endothelial cell adhesion molecule1, PECAM-1）也称为分化抗原簇31（cluster of differentiation31, CD31）表达；免疫组织化学法检测肝组织中F4/80表达；Real time Q-PCR和Western blot方法检测肝组织中MMP-13和TIMP-1表达。
　　结果：1)天狼猩红染色后统计各组中纤维结缔组织所占面积百分比， Oil/WT组与 Oil/Tg组之间差异无统计学意义（0.27%±0.06% vs0.25%±0.08%, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg组、CCl4 Re1 wk/Tg组和CCl4 Re2 wk/Tg组均明显高于相对应的CCl46 wk/WT组、CCl4 Re1 wk/WT组和CCl4 Re2 wk/WT组；CCl4 Re1 wk/Tg组天狼猩红染色阳性面积百分比较CCl46 wk/Tg组下降约1.07%，CCl4 Re1 wk/WT组较CCl46 wk/WT组下降约1.08%；CCl4 Re2 wk/Tg组天狼猩红染色阳性面积百分比较CCl4 Re1 wk/Tg组下降约0.52%，CCl4 Re2 wk/WT组天狼猩红染色阳性面积百分比较CCl4 Re1 wk/WT组下降约0.83%。检测各组羟脯氨酸含量，Oil/WT组与Oil/Tg组之间差异无统计学意义（92μg/g±10μg/g vs89μg/g±7μg/g, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg组、CCl4 Re1 wk/Tg组和CCl4 Re2 wk/Tg组均明显高于相对应的CCl46 wk/WT组、CCl4 Re1 wk/WT组和CCl4 Re2 wk/WT组；CCl4 Re1 wk/WT组羟脯氨酸含量较CCl46 wk/WT组下降约23μg/g，而CCl4 Re1 wk/Tg组较CCl46 wk/Tg组下降约17μg/g；CCl4 Re2 wk/WT组羟脯氨酸含量较CCl4 Re1 wk/WT组下降约42μg/g，而CCl4 Re2 wk/Tg组较CCl4 Re1 wk/Tg组下降约31μg/g。2)应用免疫组织化学染色、Real time Q-PCR和Western blot方法检测肝组织中Collagen1α1表达，结果发现Oil/WT组与Oil/Tg组之间差异无统计学意义；CCl46 wk/Tg组、CCl4 Re1 wk/Tg组和CCl4 Re2 wk/Tg组中Collagen1α1表达均明显高于相对应的CCl46 wk/WT组、CCl4 Re1 wk/WT组和CCl4 Re2 wk/WT组。3)免疫组织荧光染色和Western blot检测CD31表达，Oil/Tg组、CCl46 wk/Tg组、CCl4 Re1 wk/Tg组和CCl4 Re2 wk/Tg组中CD31表达均明显低于相对应的Oil/WT组、CCl46 wk/WT组、CCl4 Re1 wk/WT组和CCl4 Re2 wk/WT组。4)免疫组织化学染色检测肝组织中F4/80表达，Oil/Tg组与Oil/WT组之间F4/80阳性染色面积差异无统计学意义（1.13%±0.37%vs1.15%±0.4%, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg组与CCl46 wk/WT组之间差异无统计学意义（3.22%±0.27%vs2.82%±0.36%, P＞0.05）；CCl4 Re1 wk/Tg组F4/80阳性染色面积明显低于CCl4 Re1 wk/WT组（4.04%±0.47% vs5.98%±1.32%, P＜0.05）；CCl4 Re2 wk/Tg组F4/80阳性染色面积明显低于CCl4 Re2 wk/WT组（1.91%±0.29%vs2.32%±0.22%, P＜0.05）。5) Real time Q-PCR和Western blot技术检测各组中MMP-13表达，Oil/WT组与Oil/Tg组之间无统计学差异，P＞0.05；CCl46 wk/Tg组与CCl46 wk/WT组相比差异无统计学意义，P＞0.05；MMP-13 mRNA在CCl4 Re1 wk/Tg组明显低于CCl4 Re1 wk/WT组（3.58±0.4 vs4.54±0.43, P＜0.01）；MMP-13 mRNA在CCl4 Re2 wk/Tg组明显低于CCl4 Re2 wk/WT组（1.85±0.3 vs2.28±0.24, P＜0.05）。MMP-13蛋白检测与上述检测结果趋势一致。6)采用Real time Q-PCR检测各组中TIMP-1 mRNA表达，Oil/WT组与Oil/Tg组之间差异无统计学意义（1.03±0.33 vs0.95±0.04, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg组TIMP-1 mRNA相对表达量明显高于CCl46 wk/WT组（5.21±0.53 vs4.14±0.56, P＜0.01）；CCl4 Re1 wk/Tg组TIMP-1 mRNA相对表达量明显高于CCl4 Re1 wk/WT组（4.12±0.62 vs3±0.44, P＜0.01）；CCl4 Re2 wk/Tg组TIMP-1 mRNA相对表达量明显高于CCl4 Re2 wk/WT组（2.39±0.54 vs1.6±0.17, P＜0.05）。Western blot技术检测各组中TIMP-1蛋白表达，结果显示：Oil/Tg组与 Oil/Tg组之间差异无统计学意义（0.32±0.05 vs0.35±0.06, P＞0.05）；CCl46 wk/Tg组TIMP-1蛋白表达明显高于CCl46 wk/WT组（0.92±0.1 vs0.64±0.06, P＜0.01）；CCl4 Re1 wk/Tg组TIMP-1蛋白表达明显高于CCl4 Re1 wk/WT组（0.78±0.07 vs0.47±0.05, P＜0.01）；CCl4 Re2 wk/Tg组 TIMP-1蛋白表达明显高于 CCl4 Re2 wk/WT组（0.55±0.1 vs0.38±0.06, P＜0.01）。
　　结论：
　　1在 CCl4诱导的实验性小鼠肝纤维化模型肝组织中和巨噬细胞内TL1A表达明显升高。
　　2在肝纤维化发生过程中，髓系细胞高表达TL1A可促进巨噬细胞向肝脏募集，加重肝功能损伤、肝细胞坏死和凋亡；上调肝组织中TGF-β1、PDGF-BB、TNF-α和IL-1β表达，从而进一步促进HSCs活化和Collagen1α1合成。
　　3高表达 TL1A的巨噬细胞可促进自身分泌 PDGF-BB、TNF-α和IL-1β；高表达TL1A的巨噬细胞培养基干预小鼠原代HSCs更显著地促进HSCs内Collagen1α1合成并抑制其降解。
　　4在小鼠肝纤维化自发逆转模型中，髓系细胞高表达TL1A通过抑制血管生成、减少巨噬细胞募集、降低MMP-13表达及升高TIMP-1表达阻止肝纤维化逆转。

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英文缩写

引言

第一部分髓系细胞高表达TL1A对实验性小鼠肝纤维化发生的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分TL1A高表达的巨噬细胞参与肝纤维化进程的机制

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分髓系细胞高表达TL1A在实验性小鼠肝纤维化逆转过程中的作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:巨噬细胞在肝脏疾病中的研究进展

致谢

个人简历