头孢曲松钠改善APP/PS1双转基因AD模型小鼠早期认知功能障碍及其机制研究

摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer?s disease, AD）是一种以进行性认知功能障碍和记忆力损害为主要临床表现的神经退行性疾病。AD的主要神经病理学特征是脑内β淀粉样多肽（β-amyloid peptides, Aβ）异常沉积形成老年斑及神经细胞内tau蛋白过度磷酸化形成神经原纤维缠结。AD的确切病因尚不清楚，可能的机制包括β淀粉样肽沉积、炎症损伤、氧化应激、自由基损伤等。其中，Aβ级联学说被认为是AD发病的中心环节。该学说认为 Aβ聚集是始动因素，Aβ聚集后损伤突触，激活神经胶质细胞并诱发炎症反应，损伤突触传递和神经元功能，最终导致痴呆。近年研究发现，脑内具有神经毒性的Aβ多为可溶性寡聚体形式，APP（amyloid precursor protein）转基因小鼠的记忆障碍通常发生在脑内淀粉样斑块出现之前，并且伴有脑内可溶性Aβ水平的明显增高。因此，脑内可溶性Aβ增多在AD早期发病中发挥重要作用。可溶性Aβ寡聚体毒性作用有多个方面，包括导致过氧化损伤、引起神经细胞凋亡、引起炎症反应、损伤突触功能等。
　　谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统内主要的兴奋性神经递质，谷氨酸能神经元末梢向突触间隙释放神经递质谷氨酸，与突触后膜或前膜的谷氨酸受体结合，通过参与突触传递可塑性、维持神经环路的功能，在认知、学习、记忆等多种生理过程中发挥重要作用，也参与介导缺血性神经元损伤、脑退行性病变等多种病理性损害。突触间隙内谷氨酸的清除主要是通过兴奋性氨基酸转运体（excitatory amino transporters, EAATs）的摄取。目前发现并克隆了5种EAATs，包括EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5。海马、大脑皮质等与学习记忆功能密切相关的脑区主要表达 EAAT2，是这些脑区内摄取谷氨酸的主要转运体，承担90％以上的谷氨酸转运功能。该转运体主要表达在星形胶质细胞，故又称为胶质细胞谷氨酸转运体（glial glutamate transporter-1, GLT-1）。
　　Aβ对谷氨酸能神经元系统以及谷氨酸转运体的影响近年受到关注。研究发现，受Aβ神经毒性的影响，AD模型动物及患者在AD早期脑内即可出现 GLT-1表达的减少。根据这一现象，我们推测 GLT-1表达减少及功能的下调，会影响谷氨酸的摄取和谷氨酸-谷氨酰胺循环过程，影响兴奋性神经递质谷氨酸的再循环及利用效率，从而引起AD早期脑内突触传递以及神经环路的功能障碍，导致学习记忆能力下降。因此，调制GLT-1以及参与谷氨酸-谷氨酰胺循环的转运体的表达可能有助于改善 AD早期的认知功能障碍，有可能成为减轻或减缓AD早期认知功能障碍出现的新靶点。
　　Rothstein等2005年在《Nature》上报道，β-内酰胺类抗生素，如头孢曲松钠（Ceftriaxone, Cef），可以特异性地增加GLT-1的表达及其对谷氨酸的摄取。因此，本研究旨在观察β-内酰胺类抗生素Cef对AD模型小鼠学习记忆能力、GLT-1表达以及谷氨酸循环的影响，探讨Cef对AD模型小鼠早期认知功能障碍的作用及其机制，为临床上AD的防治提供新线索和思路。
　　第一部分 Cef改善APP/PS1双转基因AD模型小鼠的认知功能障碍
　　本实验所采用的APPswe/PS1deltaE9双转基因AD模型小鼠（APP/PS1 AD小鼠）是以C57BL/6J小鼠为背景，含有人APPswedish突变位点（ K595N/M596L）和人PS1deltaE9突变位点，是利用PrP-hAPPK595N/M596L痴呆症模型小鼠和PrP-PS1dE9痴呆症模型小鼠杂交培育而成。该模型小鼠5月龄开始出现老年斑，12月龄出现大量老年斑，具有和AD相似的病理表现。
　　目的：
　　观察Cef对7月龄和6月龄APP/PS1 AD小鼠认知功能的影响，为证明Cef可以改善APP/PS1 AD小鼠的早期认知功能障碍提供实验依据。
　　方法：
　　1 Cef对7月龄APP/PS1 AD小鼠认知功能的影响
　　选用6.5月龄APP/PS1 AD小鼠及同龄野生型（wild type）C57小鼠共82只，雌雄不拘。分为3组：
　　1) Wild type组（n=18）：动物不做任何处理，满7月龄时进行行为学测定。
　　2) APP/PS1模型组（n=25）：自APP/PS1 AD小鼠6.5月龄开始，腹腔给予与Cef treatment组等体积的生理盐水，每天一次，共14天。
　　3) Cef treatment组（n=39）：给6.5月龄APP/PS1 AD小鼠腹腔注射Cef溶液（浓度为25%），每天1次，共14天。根据Cef的剂量，分为100 mg/kg（n=12），200 mg/kg（n=15）和300 mg/kg（n=12）三个亚组。
　　以上各组小鼠给药14天后（满7月龄时），应用新物体识别实验和Morris水迷宫实验测定动物的认知功能。
　　2 Cef对6月龄APP/PS1 AD小鼠认知功能的影响
　　选用5.5月龄APP/PS1 AD小鼠及同龄野生型（wild type）C57小鼠共76只，雌雄不拘，动物分组、各组的处理以及行为学测试均与7月龄部分相同。
　　结果：
　　7月龄组小鼠
　　新物体识别实验中，1 h时间点时，与Wild type小鼠相比，APP/PS1 AD小鼠认知指数明显降低（P<0.05）；与APP/PS1模型组小鼠相比，腹腔注射Cef200 mg/Kg和300 mg/Kg显著提高了APP/PS1 AD小鼠的认知指数（P<0.05）；Cef100 mg/Kg组则无明显变化。24 h时间点各组结果与1 h时相似。这些结果表明Cef可改善7月龄APP/PS1 AD小鼠的识别记忆能力。
　　Morris水迷宫测试显示，与Wild type小鼠相比，APP/PS1 AD小鼠定位航行实验中逃避潜伏期显著延长，空间探索实验中穿越平台所在象限的次数和在目标象限内滞留时间均明显减少（P<0.05）。与 APP/PS1模型组小鼠相比，Cef处理（200 mg/kg和300 mg/kg）可使APP/PS1 AD小鼠的逃避潜伏期显著缩短（P<0.05），在目标象限的滞留时间和穿越平台所在象限的次数（仅Cef200 mg/kg组）明显增加（P<0.05）。Cef100 mg/Kg组小鼠的各项指标与 APP/PS1模型组小鼠相比则无明显变化。这些结果表明Cef可改善7月龄APP/PS1 AD小鼠的空间学习记忆能力。
　　6月龄组小鼠
　　新物体识别实验中，在1 h时间点，与Wild type小鼠相比，APP/PS1 AD小鼠的认知指数显著降低（P<0.05）；与APP/PS1模型组小鼠相比， Cef处理（200 mg/kg）显著增加APP/PS1 AD小鼠的认知指数（P<0.05）。24 h时，与APP/PS1模型组小鼠相比，Cef（300 mg/kg）显著提高了APP/PS1 AD小鼠的认知指数（P<0.05）。这些结果表明Cef也可改善6月龄APP/PS1AD小鼠的识别记忆能力。
　　Morris水迷宫测试显示，与Wild type小鼠相比，APP/PS1 AD小鼠定位航行实验中逃避潜伏期显著延长，空间探索实验中穿越平台所在象限的次数和在目标象限内的滞留时间均明显减少（P<0.05）。与 APP/PS1模型组小鼠相比，Cef处理（200 mg/kg和300 mg/kg）可使APP/PS1 AD小鼠的逃避潜伏期显著缩短（P<0.05）；同时，Cef处理（300 mg/kg组）还可使 APP/PS1 AD小鼠穿越平台所在象限的次数和在目标象限内的滞留时间显著增加（P<0.05）。Cef100 mg/Kg组小鼠的各项指标与APP/PS1模型组小鼠相比则无明显变化。这些结果表明 Cef也可改善6月龄APP/PS1 AD小鼠的空间学习记忆能力。
　　小结：
　　Cef可以提高APP/PS1 AD小鼠早期阶段对新物体的识别能力，改善其空间学习和记忆的能力。
　　第二部分 Cef上调APP/PS1 AD小鼠海马GLT-1表达
　　目的：
　　观察Cef对6月龄和7月龄APP/PS1 AD小鼠海马GLT-1表达的影响。
　　方法：
　　选用5.5月龄及6.5月龄APP/PS1 AD小鼠及同龄野生型（wild type） C57小鼠共50只，雌雄不拘，分为3组：
　　1) Wild type组（C57）（n=10）：动物不做任何处理，满6月龄(n=5)（或7月龄，n=5）时进行行为学测定。
　　2) APP/PS1模型组（n=10）：自小鼠5.5月龄(n=5)（或6.5月龄，n=5）开始，腹腔给予与Cef treatment组等体积的生理盐水，每天一次，共14天。
　　3) Cef treatment组（n=30）：给5.5月龄(n=15)（或6.5月龄，n=15） APP/PS1 AD小鼠腹腔注射Cef溶液（浓度为25%），每天1次，共14天。根据Cef的剂量，分为100 mg/kg（n=5），200 mg/kg（n=5）和300 mg/kg（n=5）三个亚组。
　　以上各组小鼠给药结束后进行行为学测定，之后即刻断头取脑，应用免疫组织化学和Western-blot方法检测小鼠海马GLT-1的表达。
　　结果：
　　7月龄组小鼠
　　免疫组化染色发现，在Wild type小鼠，GLT-1有一定基础表达，免疫阳性颗粒弥漫性分布于海马各区；与Wild type小鼠相比，APP/PS1 AD小鼠海马CA1区GLT-1染色较浅，免疫反应阳性颗粒显著减少，阳性染色的光密度值显著下降（P<0.05）；与APP/PS1模型组小鼠相比，Cef治疗组中，无论是100 mg/kg组、200 mg/kg还是300 mg/kg组，其GLT-1的免疫阳性颗粒均显著增多，着色加深，阳性染色的光密度值显著增加（P<0.05）。
　　Western blot分析显示，在Wild type小鼠，GLT-1有一定基础表达；与Wild type小鼠相比，APP/PS1 AD小鼠海马GLT-1表达下调，表现为条带着色显著变浅，与β-actin的IOD值的比值降低（P<0.05）。与APP/PS1模型组小鼠相比，Cef处理（200 mg/kg和300 mg/kg），可显著上调GLT-1表达，表现为条带着色显著加深，与β-actin的 IOD值的比值显著升高（P<0.05）。
　　6月龄组小鼠
　　Cef对6月龄 APP/PS1 AD小鼠海马 GLT-1表达的影响与7月龄APP/PS1 AD小鼠一致。
　　小结：
　　Cef可上调6月龄和7月龄APP/PS1 AD小鼠海马GLT-1的表达。
　　第三部分 Cef促进APP/PS1 AD小鼠海马谷氨酸-谷氨酰胺循环及谷氨酸释放调节的相关蛋白的表达或活性
　　目的：
　　观察Cef对APP/PS1 AD小鼠海马谷氨酰胺合酶(Glutamine synthetase, GS)、谷氨酸转运体N-1系统(SN1)表达或活性的变化，探讨Cef对APP/PS1 AD小鼠海马谷氨酸-谷氨酰胺循环的影响；观察Cef对代谢型谷氨酸受体2/3（metabotropic glutamate receptor2/3, mGluR2/3）表达的影响，探讨Cef对APP/PS1 AD小鼠谷氨酸释放调节的影响。
　　方法：
　　选用5.5月龄APP/PS1 AD小鼠及同龄野生型（Wild type）C57小鼠共25只，雌雄不拘，分为以下3组：
　　1) Wild type组（C57）（n=5）：动物不做任何处理，满6月龄时进行行为学测定。
　　2) APP/PS1模型组（n=5）：自小鼠5.5月龄开始，腹腔给予与Cef治疗组等体积的生理盐水，每天一次，共14天。
　　3) Cef treatment组（n=15）：给5.5月龄APP/PS1 AD小鼠腹腔注射Cef溶液（浓度为25%），每天1次，共14天。根据Cef的剂量，分为100 mg/kg（n=5），200 mg/kg（n=5）和300 mg/kg（n=5）三个亚组。
　　以上各组小鼠给药结束后进行行为学测定，之后即刻断头取脑，应用Western-blot方法检测小鼠海马SN1、mGluR2/3的表达以及GS的表达和活性测定。
　　结果：
　　在Wild type小鼠，SN1、mGluR2/3均有一定基础表达；与Wild type小鼠相比，APP/PS1 AD小鼠海马SN1、mGluR2/3蛋白表达下调，表现为条带着色显著变浅，与β-actin(或 GAPDH)的 IOD值的比值降低（P<0.05）。与 APP/PS1模型组小鼠相比，Cef处理（200 mg/kg和300 mg/kg），可显著上调SN1、mGluR2/3蛋白的表达，表现为条带着色显著加深，与β-actin(GAPDH)的IOD值的比值显著升高（P<0.05）。GS的表达在Cef处理前后没有明显变化（P>0.05），但测定其活性，APP/PS1模型组小鼠显著低于Wild type小鼠（P<0.05），而给予Cef处理可显著提高其活性，表现为Cef治疗组（200 mg和300 mg）小鼠的GS活性明显高于APP/PS1模型组小鼠（P<0.05）。
　　小结：
　　Cef上调了SN1、mGluR2/3的表达，增强了GS的活性。
　　结论：
　　Cef可以改善APP/PS1 AD模型小鼠的认知功能，其机制可能与Cef上调APP/PS1 AD模型小鼠海马GLT-1表达，增强谷氨酸-谷氨酰胺循环过程，增加突出前膜可释放谷氨酸的数量，提高谷氨酸作为神经递质的利用效率有关。

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引言

第一部分头孢曲松钠改善APP/PS1 AD 模型小鼠早期认知功能障碍

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分头孢曲松钠上调APP/PS1 AD模型小鼠海马GLT-1表达

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分头孢曲松钠促进APP/PS1 AD模型小鼠海马谷氨酸-谷氨酰胺的循环及谷氨酸释放调节的相关蛋白的表达或活性

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述一:阿尔茨海默病转基因小鼠与认知功能障碍

综述二:阿尔茨海默病啮齿动物模型比较

致谢

个人简历