甘草素改善去卵巢APP/PS1双转基因小鼠认知功能障碍及机制研究

摘要

目的：研究甘草素对去卵巢APP/PS1双转基因阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）模型小鼠的学习记忆能力、老年斑、神经元丢失、凋亡及自噬等的影响，并探讨相关作用机制。本课题研究的多靶向植物雌激素将为临床上AD的防治提供新的实验依据。
　　方法：将40只3月龄雌性APP/PS1双转基因小鼠行假手术或双侧卵巢切除术，7天后随机分为四组：假手术组（Sham）、卵巢切除组（OVX）、卵巢切除后给予甘草素治疗组（LG）、卵巢切除后给予雌二醇治疗组（E2）。甘草素剂量为30mg/kg·d，雌二醇为0.1mg/kg。甘草素为灌胃处理，雌二醇为皮下注射。安慰剂为生理盐水和（或）1％CMC-Na。
　　药物治疗90天后，先后进行高架十字迷宫、Morris水迷宫实验分别检测各组实验小鼠的焦虑抑郁情绪与空间学习记忆能力的变化；称重小鼠子宫并观察其形态变化情况；使用免疫组化检测脑内老年斑数量与面积、神经元及突触形态与数量的变化；通过Western blot检测脑内β-分泌酶活性、雌激素受体、神经营养因子、凋亡及自噬等的变化；采用流式细胞技术检测脑内神经元的凋亡及线粒体膜电位变化情况。
　　结果：
　　1.行为学检测结果：①在高架十字迷宫检测结果中：Sham组、LG组和 E2组穿越开臂的次数和停留时间均显著高于OVX组（P<0.05），而这三组组间无显著差异（P>0.05）；②Morris水迷宫检测结果显示：在可视平台实验中，各组小鼠找到平台的平均潜伏期、搜索路径及游泳速度无明显异（P>0.05）；在隐蔽平台试验检测中，Sham组、LG组和E2组找到平台的平均时间及搜索平台的平均路程较OVX组明显缩短（P<0.01），该三组间无明显差异（P>0.05）；在探索实验检测中，60s内E2组和Sham组穿越平台的次数显著高于OVX组（P<0.01），LG组明显增加（P<0.05）。
　　2.小鼠子宫形态及重量显示：LG组、E2组和Sham组小鼠子宫重量均显著大于OVX组（P<0.01），E2组子宫增殖更为明显并有结节形成。
　　3.在免疫组化实验检测结果显示：与Sham组小鼠相比，OVX组小鼠脑内老年斑（SP）数量及面积明显增加（P<0.01），LG组较OVX组明显减少（P<0.05），E2组较OVX组显著减少（P<0.01），Aβ40及Aβ42检测结果与上述一致；OVX组较Sham组突触减少、断裂且排列紊乱，LG组与E2组突触排列更规则整齐、连续；与Sham组相比，OVX组神经元数量明显减少（P<0.05），甘草素治疗后增多（P<0.05）。
　　4.在WB检测结果中显示：各组小鼠脑内APP全蛋白表达无明显变化，与OVX组相比，LG组、E2组和Sham组BACE1、Bax的表达明显下降（P<0.05），神经元、神经元前体及突触相关蛋白：NeuN、DCX及PSD95表达明显增多（P<0.05），ERβ、BDNF、GDNF、Bcl-2表达水平明显上升（P<0.05），自噬相关蛋白Beclin1和LC3表达增强（P<0.05）。
　　5.在流式细胞检测结果中显示：LG组、E2组和Sham组细胞凋亡明显减少，线粒体膜电位下降减少。
　　结论：
　　1.甘草素治疗能改善去卵巢APP/PS1双转基因小鼠的空间学习记忆能力，减轻其焦虑抑郁情绪；
　　2.甘草素能使去卵巢APP/PS1双转基因小鼠子宫重量增加，但不及假手术组，而雌二醇组则显著增殖并有结节形成，甘草素具有更低的毒副作用；
　　3.甘草素治疗可减少小鼠脑内Aβ的沉积及老年斑的形成，其机制可能是与抑制了BACE1活性、增强自噬活性有关；
　　4.甘草素能增加去卵巢AD模型小鼠脑内ERβ表达，并增加BDNF、GDNF等神经营养因子的表达；
　　5.甘草素能通过抑制神经元的凋亡及线粒体膜电位下降，减少去卵巢APP/PS1双转基因小鼠脑内神经元及突触的丢失。

目录

封面

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英汉缩略语对照表

中文摘要

英文摘要

前言

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

1.2 主要实验仪器

1.3 主要试剂与配制

1.4 实验方法与步骤

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 AD模型小鼠的基因鉴定

2.2 各组APP/PS1双转基因小鼠体重变化情况

2.3 甘草素或雌二醇治疗对小鼠子宫外观及重量的影响

2.4 长期药物治疗后对小鼠行为学的影响

2.5 甘草素治疗对实验小鼠脑内Aβ和老年斑的影响

2.6 甘草素治疗对实验小鼠脑内雌激素受体beta（ERβ）及相关神经营养因子的影响

2.7 甘草素治疗对实验小鼠脑内神经元及突触的影响

2.8 甘草素治疗对实验小鼠脑内凋亡及自噬的影响

3 讨 论

3.1 AD药物治疗概述

3.2 去卵巢APP/PS1双转基因小鼠模型评价

3.3 甘草素对去卵巢APP/PS1双转基因小鼠生殖系统影响及脑内ERβ与相关神经营养因子水平的影响

3.4 甘草素对去卵巢APP/PS1双转基因小鼠行为学的影响

3.5 甘草素改善去卵巢APP/PS1双转基因小鼠焦虑抑郁及认知功能损害的可能机制

全文总结

参考文献

文献综述:植物雌激素及其对阿尔茨海默病的保护作用研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文