转录因子KLF5在腹主动脉瘤形成中的作用及机制研究

摘要

腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysms，AAA）是一种慢性炎症性疾病，其病理特征是主动脉壁的重塑，常常由于主动脉夹层动脉瘤破裂而导致病人死亡。AAA的形成是与多种因素有关，包括巨噬细胞的浸润，炎性因子和蛋白酶的释放，弹力纤维的断裂，血管平滑肌细胞的凋亡，胶原蛋白降解等，其中巨噬细胞浸润在AAA的发病机理中具有重要作用。研究已经报道，慢性炎症状态（包括动脉粥样硬化、氧化应激、血管紧张素II和炎性细胞因子）激活单核/巨噬细胞，被激活的巨噬细胞渗透到血管壁并释放蛋白酶，降解细胞外基质成分，包括胶原蛋白和弹性蛋白；同时，浸润进血管壁的巨噬细胞在血管中膜和外膜分泌炎性细胞因子，如：TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6，进一步加剧炎症反应。
　　巨噬细胞浸润至血管壁的过程需要肌动蛋白细胞骨架的重新组构。在巨噬细胞浸润过程中产生一种膜突出结构：伪足小体（podosome）。目前已知，多种细胞结蛋白和信号蛋白以肌丝蛋白为核心包裹行成的束状podosome参与细胞的局部黏附和迁移。束状 podosome呈现为点状的染色，寿命2-10 min左右，但在炎症环境下，束状podosome逐渐积聚变为环形podosome（称为podosome rosette），这种结构可持续数小时，持续进行细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）消化并促使细胞迁移。此外，podosome还包含多个信号蛋白，其中RhoA是podosome形成的一个关键信号分子。但是，目前关于podosome形成及其与巨噬细胞迁移的关系仍不清楚。
　　Myo9b作为一种与肌丝蛋白相关的马达蛋白，其分子中包含的RhoGAP蛋白结构域具有抑制Rho信号的作用，因而能够调节巨噬细胞的极性和迁移。尽管Myo9b在破骨细胞中表达并调节podosome形成已有报道，但是Myo9b与动脉瘤发生发展之间的联系尚未阐明。
　　人类Krüppel样因子5（KLF5）属于SP/KLF转录因子家族，其在羧基末端具有三个共同的C2H2型锌指结构。大量研究表明KLF5可以激活多种与心血管重塑相关的基因。已有报道，KLF5在大型未破裂的脑动脉瘤中高度表达，但是KLF5介导AAA形成的确切机制尚不清楚。在AAA形成过程中，KLF5与 podosome形成和巨噬细胞浸润的关系仍然未知。因此，本研究利用CaPO4诱导的小鼠腹主动脉瘤模型和人AAA组织，探讨Myo9b在KLF5介导的巨噬细胞podosome形成和巨噬细胞浸润中的作用，旨在为阐明KLF5在动脉瘤中的作用机制提供实验基础。
　　第一部分 KLF5通过促进巨噬细胞的迁移参与腹主动脉瘤的形成
　　目的：探讨KLF5对巨噬细胞迁移的影响及其在AAA形成中的作用。
　　方法：1通过实时定量PCR（qRT-PCR）和免疫组化检测人AAA组织中KLF5的表达，免疫双荧光共定位检测KLF5在血管组织中巨噬细胞和VSMCs的表达。2构建CaPO4诱导的小鼠AAA模型，HE染色证实模型成功。qRT-PCR和免疫组化检测小鼠AAA组织中KLF5的表达。免疫双荧光共定位检测KLF5在小鼠AAA组织巨噬细胞和VSMCs中的表达。3杂交培育骨髓源单核细胞KLF5基因特异性敲除小鼠并建立AAA模型。4 HE和EVG染色检查血管组织和弹力纤维的变化。5免疫双荧光共定位KLF5和巨噬细胞。
　　结果：
　　1人AAA组织中KLF5表达升高
　　与人正常主动脉组织相比，人AAA组织中KLF5mRNA表达水平升高，免疫组化KLF5染色阳性细胞数增加。对巨噬细胞和平滑肌细胞标志物进行免疫荧光染色的结果显示，在人AAA组织中巨噬细胞明显增多，并且平滑肌细胞和巨噬细胞中KLF5表达均明显增多，说明KLF5表达水平升高可能在AAA形成中发挥作用。
　　2 CaPO4诱导的小鼠AAA中KLF5表达水平增加
　　在形态学检查证实，用CaPO4诱导成功建立小鼠AAA模型的基础上，检查KLF5在实验型AAA组织中的表达变化。qRT-PCR结果显示，KLF5 mRNA表达水平随着CaPO4诱导天数的增加而升高，在第7天和第14天分别升高了2.39倍和2.14倍。免疫荧光染色结果证实，KLF5在巨噬细胞和VSMCs中均有表达，这与在人AAA组织中的检测结果相同。这些结果表明，KLF5参与人和小鼠AAA的形成。
　　3巨噬细胞特异性敲除KLF5能减缓CaPO4诱导的小鼠AAA形成
　　KLF5-flox小鼠和 LysM-cre小鼠杂交培育遗传性敲除巨噬细胞中KLF5的小鼠（KLF5-/-），与野生型（WT）小鼠相比，KLF5-/-小鼠经CaPO4诱导的腹主动脉膨胀率显著降低。HE染色结果显示，KLF5-/-小鼠的腹主动脉组织结构接近正常，弹力纤维断裂与WT组比较明显减少。结果显示KLF5-/-小鼠腹主动脉的弹力纤维断裂与WT组比较明显减少。免疫荧光染色结果显示，与WT组比较，在KLF5-/-小鼠的血管组织中，KLF5染色阳性巨噬细胞数量明显减少。这些结果表明，KLF5通过促进巨噬细胞浸润而参与AAA形成。
　　小结：
　　KLF5在人和CaPO4诱导的小鼠AAA组织中表达升高。KLF5在血管平滑肌细胞和巨噬细胞中均进行表达。巨噬细胞特异性敲除KLF5能够减少巨噬细胞的浸润，抑制CaPO4诱导的小鼠AAA的形成。
　　第二部分 KLF5通过上调Myo9b表达促进巨噬细胞podosome的形成和迁移
　　目的：揭示 KLF5促进巨噬细胞迁移和浸润的分子与细胞生物学机制。
　　方法：1体外细胞划痕实验观察 WT和 KLF5-/-巨噬细胞的迁移。2 Transwell小室实验观察WT和KLF5-/-巨噬细胞的侵袭能力。3扫描电镜观察巨噬细胞跨膜迁移时细胞足突。4活细胞工作站观察 WT和 KLF5-/-巨噬细胞的径向运动变化。5 mRNA表达谱芯片检测WT和KLF5-/-巨噬细胞的基因表达差异。6 qRT-PCR检测细胞运动相关基因的表达。7在巨噬细胞中过表达和敲低KLF5后检查运动相关基因的表达变化。8报告基因检测KLF5对Myo9b基因启动子的转录活性。9 Oligo pull-down分析确定KLF5在Myo9b基因启动子上的结合位点。
　　结果：
　　1 KLF5-/-巨噬细胞的迁移功能受损
　　从KLF5-/-和WT小鼠分离培养骨髓源巨噬细胞，划痕实验结果表明， KLF5-/-巨噬细胞的迁移进入划痕区域的细胞数量比 WT巨噬细胞显著减少。Transwell小室实验证实，与WT巨噬细胞相比，KLF5-/-巨噬细胞的侵袭能力受损。扫描电镜观察结果显示，与WT巨噬细胞相比，KLF5-/-巨噬细胞具有更少、更短的突触和伪足。细胞免疫双荧光染色结果显示，跨越滤膜的KLF5-/-巨噬细胞几乎不表达KLF5。进一步用动态细胞成像技术观察发现，与WT巨噬细胞相比，KLF5-/-巨噬细胞的径向迁移能力受损，迁移速率明显降低。
　　2 KLF5通过直接与Myo9b启动子结合而上调Myo9b表达
　　mRNA表达谱芯片检测结果显示，与 WT组比较，KLF5-/-小鼠的运动相关基因在CaPO4损伤的主动脉组织中表达显著下降。Gene Ontology富集分析发现，差异表达的基因主要集中于细胞 Myosin肌丝和 Myosin复合物等蛋白相关基因。qRT-PCR对芯片分析结果进行验证，Myo9a、Myo9b和Macf1基因表达在KLF5-/-小鼠显著下调。分别在Raw264.7中过表达或敲低 KLF5，PCR和 Western blotting结果均显示，在基础水平和TNF-α诱导情况下，在巨噬细胞中过表达或敲低KLF5均能够显著增加或降低Myo9a和Myo9b的mRNA和蛋白水平。报告基因和Oligo pull-down分析结果表明，KLF5通过直接与Myo9b启动子上的TCE位点结合而激活Myo9b基因表达。
　　3 KLF5缺失导致Myo9b表达下调及podosome形成减少
　　免疫荧光染色结果显示，Myo9b与 podosome共定位。PDBu促进WT巨噬细胞形成 podosome，但在 PDBu处理的 KLF5-/-巨噬细胞中podosome数量显著减少。Podosome阳性细胞数在TNF-α诱导的WT巨噬细胞中显著升高，但无论TNF-α诱导与否，KLF5-/-巨噬细胞中的podosome阳性细胞数均较少。Myo9b与Vinculin、Tks5或F-actin共定位的染色结果进一步证实， Myo9b定位于巨噬细胞的 podosome中。Myo9a不与Cortactin和F-actin在podosome中共定位。在KLF5-/-巨噬细胞中过表达KLF5能够恢复podosome的形成。体内研究结果同样证实，podosome结构在人和小鼠AAA组织中与体外细胞中的结构相似。
　　小结：
　　KLF5在巨噬细胞中缺失造成细胞迁移功能受损。在巨噬细胞中， Myo9b是KLF5的直接靶基因，KLF5通过直接与Myo9b启动子上的TCE位点相互作用激活Myo9b基因转录，KLF5缺失通过导致Myo9b表达下调而减少podosome形成。
　　第三部分 Myo9b通过负性调节RhoA信号促进巨噬细胞podosome的形成、迁移和AAA进展
　　目的：探索KLF5及受其调控的Myo9b调节巨噬细胞podosome形成的分子机制。
　　方法：1用si-RNA敲低巨噬细胞中内源性Myo9b的表达，细胞免疫荧光染色观察podosome的形成是否发生变化。2 Transwell小室实验观察Myo9b敲低对巨噬细胞侵袭能力的影响。3在Myo9b的巨噬细胞中过表达KLF5后经免疫荧光染色观察podosome的形成。4用TNF-α刺激巨噬细胞后，GTPase pull-down和Western blot检测巨噬细胞中与GTP结合的RhoA、Cdc42和Rac1及其总蛋白水平。5在巨噬细胞中分别过表达或敲低KLF5，GTPase pull-down和Western blot检测RhoA、Cdc42和Rac1的激活和Myo9b表达变化。6用上述方法检查RhoA特异性抑制剂对巨噬细胞podosome形成和细胞迁移的影响。7免疫双荧光染色和qRT-PCR检测人AAA组织中Myo9b的表达和定位。
　　结果：
　　1 Myo9b敲低减少TNF-α诱导的巨噬细胞podosome的形成和迁移
　　用Myo9b特异性siRNA（si-Myo9b）和非特异性siRNA（si-NS）转染巨噬细胞，细胞免疫荧光染色结果显示，与转染si-NS的细胞相比，在转染 si-Myo9b的细胞中 PDBu诱导的 podosome形成显著减少，而且Myo9b敲低后，podosome的形成不再受TNF-α的影响。Transwell结果显示，Myo9b敲低后，穿越滤膜的巨噬细胞的数目显著低于转染si-NS的细胞。反之，在巨噬细胞中过表达KLF5能够促进podosome的形成，但是这种效应在转染si-Myo9b的巨噬细胞中被取消。
　　2在巨噬细胞中KLF5敲低或缺失增加RhoA-GTP水平
　　GTPase pull-down和Western blot结果显示，在TNF-α刺激的巨噬细胞中，与GTP结合的Cdc42、Rac1和RhoA水平显著增加，其中RhoA-GTP水平在30min达到峰值，6 h恢复至基础水平。与此同时，伴随着RhoA-GTP水平的下降，Myo9b的表达水平增加。在巨噬细胞中敲低或过表达KLF5后，经GTPase pull-down和Western blot检查Myo9b表达及RhoA-GTP水平的变化。结果表明，过表达KLF5显著上调Myo9b的表达，并且减少RhoA-GTP的水平；敲低KLF5显著下调Myo9b的表达，增加RhoA-GTP的水平。免疫荧光结果显示，与Rhosin处理的WT巨噬细胞相比，KLF5-/-巨噬细胞经Rhosin处理后，PDBu诱导形成的podosome数目显著增多。Transwell结果显示，与未经处理的KLF5-/-巨噬细胞相比，Rhosin处理后细胞侵袭能力显著增加。
　　3在人组织中Myo9b表达上调并且定位于巨噬细胞
　　免疫双荧光染色结果显示，人AAA组织中Myo9b的表达与正常组比较显著升高，且主要定位于MAC2阳性的巨噬细胞。qRT-PCR结果表明， Myo9bmRNA水平在人AAA组织中显著高于正常腹主动脉组织。相关性分析结果显示，KLF5mRNA水平与AAA的膨胀率的相关性并不明显（P＞0.05），但是Myo9bmRNA水平与AAA的膨胀率具有显著正相关性（P＜0.05）。
　　小结：
　　敲低Myo9b能显著减少TNF-α诱导的巨噬细胞podosome的形成和迁移。在巨噬细胞中，KLF5敲低或缺失增加RhoA-GTP的水平；KLF5通过上调Myo9b表达而抑制RhoA信号途径以及podosome的形成。巨噬细胞中Myo9b表达上调与人AAA的发生发展相关。
　　结论：
　　1 KLF5促使巨噬细胞迁移和动脉瘤形成。
　　2在巨噬细胞中Myo9b是KLF5的直接靶基因。
　　3 KLF5促进podosome形成和巨噬细胞迁移以及Myo9b的表达。
　　4 Myo9b通过负性调节RhoA信号促进巨噬细胞podosome的形成、迁移和AAA进展。

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引言

第一部分KLF5通过促进巨噬细胞迁移参与腹主动脉瘤的形成

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分KLF5通过上调Myo9b表达促进巨噬细胞podosome的形成和迁移

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分Myo9b通过负性调节RhoA信号促进巨噬细胞podosome的形成、迁移和AAA进展

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:KLF5与腹主动脉瘤

致谢

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