TLR2对骨骼肌线粒体生物发生及胰岛素敏感性的影响

摘要

近年来对胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）的病因学研究成为一个热点，因为 IR贯穿于高脂血症、糖尿病、高血压、痛风等多种代谢相关疾病，是这些疾病的共同土壤。众多研究资料表明炎症反应是IR发生的重要机制。从发现第一个与胰岛素抵抗相关的炎性细胞因子肿瘤坏死因子α（TNFα）以来，炎症机制已成为肥胖相关胰岛素抵抗的研究热点。肥胖状态下的炎症是一种低度的慢性炎症反应。TOLL样受体(Toll-like receptors, TLRs)作为模式识别受体不仅在感染免疫和损伤诱导的炎症反应中发挥重要作用，还参与代谢相关疾病的发生发展。
　　TOLL样受体2(TLR2)是已克隆出的TOLL样受体家族中表达范围最广，识别病原微生物种类最多的成员。TLR2主要在哺乳动物的肺脏、心脏、大脑和肌肉组织中表达，其最突出的生物学功能就是直接或间接促进炎症因子的合成与释放。人类及啮齿类动物血浆葡萄糖60％~70%在骨骼肌代谢，骨骼肌是胰岛素刺激葡萄糖摄取的主要部位。
　　脂代谢在骨骼肌胰岛素抵抗形成中扮演重要角色，线粒体是脂肪酸氧化的部位，表明线粒体功能在骨骼肌胰岛素抵抗形成中的重要地位。因此研究TLR2对骨骼肌线粒体生物发生、胰岛素抵抗的影响对代谢性疾病的防治具有重要的意义，为寻求糖尿病治疗新靶点提供科学依据。
　　棕榈酸(Palmitate acid, PA)是游离脂肪酸中最主要的饱和脂肪酸，用其孵育可致细胞产生胰岛素抵抗，是建立体外细胞胰岛素抵抗模型的常用方法之一。本课题采用PA孵育L6成肌细胞构建胰岛素抵抗模型，并通过质粒上调和siRNA下调肌细胞中TLR2的表达，探究饱和脂肪酸是否是通过TLR2的表达影响骨骼肌线粒体生物发生，进而导致胰岛素抵抗。
　　目的：研究TLR2对棕榈酸所致骨骼肌胰岛素抵抗的作用及其机制。
　　方法：培养原始L6成肌细胞，使其分化成骨骼肌细胞，并用PA孵育，建立胰岛素抵抗模型。随后进行如下分组：对照组（control），棕榈酸组（PA），棕榈酸siRNA阴性对照组（PA+NC-siRNA），棕榈酸TLR2敲低组（PA+si-TLR2），棕榈酸空质粒组（PA+pcDNA），棕榈酸TLR2过表达组（PA+pcDNA/TLR2）。通过RT-PCR及Western blot方法检测TLR2 mRNA及蛋白表达水平，确定转染成功后，用葡萄糖氧化酶法测定各组细胞培养基中葡萄糖浓度，评价胰岛素的敏感性。采用ELISA方法测定六组培养基中炎症因子TNFα及 IL-1β的浓度。采用 RT-PCR和Western blotting方法检测六组样本骨骼肌细胞中TLR2蛋白的表达水平，采用Western blotting方法检测六组样本骨骼肌细胞中线粒体生物发生相关蛋白PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰岛素信号通路PI3K、P-AKT、GLUT4蛋白的表达水平。多样本比较采用单因素方差分析，两样本间比较采用t检验。
　　结果：
　　1.成功分化骨骼肌细胞
　　分化组标志性分化基因Desmin和Myogenin的mRNA表达较未分化组明显增加，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　2.胰岛素抵抗模型的建立
　　成功分化的骨骼肌细胞，分为正常对照组和棕榈酸干预组。分别在12h、16h、20h、24h测定两组培养基葡萄糖浓度，在24h时，棕榈酸干预组葡萄糖浓度明显高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　3.转染成功后六组样本葡萄糖浓度及炎症因子TNFα和IL-1β的变化
　　PA组培养基中葡萄糖浓度及炎症因子TNFα和IL-1β较control组明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　PA+NC-siRNA组和PA+pcDNA组较PA组葡萄糖浓度及炎症因子TNFα和IL-1β无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；
　　PA+si-TLR2组较PA+NC-siRNA组葡萄糖浓度及炎症因子TNFα和IL-1β明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　PA+pcDNA/TLR2组较PA+pcDNA组葡萄糖浓度及炎症因子TNFα和IL-1β明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　4.转染成功后六组样本TLR2的表达
　　与control组相比，PA组TLR2的表达明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　PA+NC-siRNA组和PA+pcDNA组较PA组TLR2的表达无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；
　　PA+si-TLR2组较PA+NC-siRNA组TLR2的表达明显下降，差异具有统计学意义（P<0.05），表明si-TLR2转染成功；
　　PA+pcDNA/TLR2组较PA+pcDNA组TLR2的表达明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）表明TLR2质粒转染成功；
　　5.转染成功后六组样本线粒体生物发生相关蛋白指标及胰岛素信号通路指标的变化
　　与control组相比， PA组线粒体生物发生相关蛋白指标PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰岛素信号通路PI3K、P-AKT、GLUT4的蛋白表达水平下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　PA+NC-siRNA组和PA+pcDNA组较PA组线粒体生物发生相关蛋白指标PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰岛素信号通路PI3K、P-AKT、GLUT4的蛋白表达水平无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；
　　PA+si-TLR2组较PA+NC-siRNA组线粒体生物发生相关蛋白指标PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰岛素信号通路PI3K、P-AKT、GLUT4的蛋白表达水平升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　PA+pcDNA/TLR2组较PA+pcDNA组线粒体生物发生相关蛋白指标PGC1α、MFN2、NRF-1以及胰岛素信号通路PI3K、P-AKT、GLUT4的蛋白表达水平下降，差异具有统计学意义（P<0.05）；
　　结论：
　　1.高脂孵育可以诱导骨骼肌细胞胰岛素抵抗，表现为葡萄糖摄取减少，同时可使TLR2增加，炎症因子TNFα和IL-1β释放增加。
　　2.抑制或过表达TLR2可影响葡萄糖摄取，炎症因子分泌，线粒体生物发生相关蛋白PGC1α、MFN2、NRF-1及胰岛素信号通路PI3K、P-AKT、GLUT4蛋白的表达，说明TLR2表达增加损伤了线粒体生物发生相关蛋白，进而引起胰岛素抵抗。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 细胞培养

2 实验方法

3 统计学处理

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:炎症信号与骨骼肌胰岛素抵抗的研究进展

致谢

个人简历