2,3-二羟基-6-硝基氨-磺酰苯喹喔啉(NBQX)对早产兔生发基质-脑室内出血后的神经保护性研究

摘要

目的：生发基质-脑室内出血（germinal matrix-intraventricular hemorrhage,GM-IVH）是早产儿最常见的脑损伤形式之一，GM-IVH占新生儿颅内出血中80％以上。在极低出生体重儿中GM-IVH的发生率在20%~25%，当体重在500~750g的早产儿发生GM-IVH的比例会上升至45%左右。研究表明，孕周越小、体重越低，GM-IVH的发生率越高。随着我国围产医学的进步及新生儿重症监护技术的提高，早产儿、极早产儿、极低出生体重儿的出生率越来越高，伴随而来的是，早产儿GM-IVH的发生率上升。GM-IVH多发生在孕周小于34周的早产儿，GM-IVH幸存患儿在后期随访中发现存在不同程度神经功能障碍、脑瘫、认知障碍、行为缺陷等情况，严重影响早产儿的生存质量，给家庭、社会带来沉重的负担。因此，GM-IVH及其所致后遗症是仍然是有待解决的重要问题。
　　早产儿中枢神经系统发育不成熟，脑损伤机制复杂，脑损伤的发病机制之一是大量兴奋性氨基酸分泌所致的兴奋毒作用，谷氨酸是常见的兴奋性氨基酸，发挥作用时必须与其受体结合，α-甲基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑基丙酸（AMPA）受体作为谷氨酸离子型受体之一，广泛分布在海马、大脑皮质、纹状体和小脑中的胶质细胞和神经元上。脑损伤后，激活AMPA受体，谷氨酸结合位于少突胶质细胞及神经元表面的AMPA受体，诱发钙超载，造成神经元细胞骨架蛋白降解、破坏，引起神经元损伤；作用于少突胶质细胞膜表面AMPA受体时，造成少突胶质细胞损伤、髓鞘形成障碍。2,3-二羟基-6-硝基氨-磺酰苯喹喔啉（NBQX）是AMPA受体的抑制剂，应用于GM-IVH患者，通过其抑制神经元及少突胶质细胞表面AMPA受体的表达，可否减轻神经元损害、保护少突胶质细胞，目前国内尚未研究报道。
　　本研究通过已经建立的GM-IVH兔模型，探讨（1）GM-IVH后髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）表达，检测髓鞘损伤情况。（2）通过检测微管相关蛋白-2（microtubule associated protein-2,MAP-2）的表达，了解GM-IVH早产兔神经元损伤情况。（3）GM-IVH早产兔应用NBQX后，是否可以减轻GM-IVH后的脱髓鞘，以及发挥对神经元的保护作用。
　　方法：
　　1.选取新西兰孕兔，孕29天（足月孕32天），进行剖宫产，迅速取出幼兔。生后迅速给予保温、奶粉喂养，于生后3小时，给予一部分早产兔50%丙三醇腹腔注射，剂量为10ml/Kg。其余不给予任何处理。
　　2.生后24小时接受头颅超声检查，观察GM-IVH的发生情况。
　　3.将发生GM-IVH的早产兔随机分为两组，NBQX治疗组（15只）和模型组（15只）。另取生后未给予任何处理的早产兔15只作为正常组。用剂量为10μL的NBQX对NBQX治疗组进行前囟注射，对照组给予同等容积的生理盐水。将NBQX治疗组、模型组、正常组的早产兔随机分为出生后3天、7天、14天三个亚组，按上述时间点给予处死，冰上剥离脑组织，一部分放入4%的多聚甲醛溶液中固定，供后期免疫组织化实验使用。另一部分放置于-80℃冰箱中，供蛋白印迹试验使用。
　　4.使用免疫组化的方法比较NBQX治疗组、模型组、正常组中早产兔脑室周围组织中微管相关蛋白-2（MAP-2）的表达情况。
　　5使用蛋白印迹方法检测NBQX治疗组、模型组、正常组中早产兔脑室周围组织中髓鞘碱性蛋白（MBP）的表达情况。
　　6统计方法：采用SPSS19.0统计学软件、Microsoft Excel2003进行统计学处理，计量资料以均数±标准差表示，检验方差齐性，多个样本均数的比较采用LSD-t检验；若方差不齐采用秩和检验。检验水准定为0.05， P值<0.05有统计学意义。
　　结果：
　　1.成功复制了早产兔GM-IVH模型。
　　对孕29天早产兔行剖宫产后获得早产兔，通过组织样本观察后证实成功制备了早产兔GM-IVH模型。
　　2.脑组织中MBP的表达。
　　用蛋白印迹实验方法检测脑组织中MBP的表达。出生后3天、7天、14天，正常组早产兔脑组织中MBP的表达量逐渐增加，三个时间点两两比较，3天和7天比较差异无统计学意义；3天和14天、7天和14天比较，差异有统计学意义。在3天、7天、14天时，模型组中MBP的表达量均低于正常组的表达量，差异有统计学意义。
　　在NBQX治疗组中，3天、7天、14天中MBP的表达量逐渐升高，3天与7天比较差异无统计学意义；3天与14天、7天与14天比较差异有统计学意义；在7天、14天时，NBQX治疗组与模型组比较，MBP的表达差异有统计学意义。
　　3.脑组织中MAP-2的表达。
　　应用免疫组化检测脑组织中MAP-2的表达。MAP-2在正常组脑组织中排列整齐，成纤维状，且随着时间的延长，脑组织中MAP-2的表达增高，3天、7天、14天两两比较有统计学差异。模型组3天脑组织中MAP-2结构完整性较差，基本无染色，表达量降低；7天时脑组织中MAP-2的表达量稍有增高；14天时，脑组织中MAP-2排列相对完整，染色仍较淡，表达较前增强，模型组中任意两时间点比较，MAP-2的表达差异有统计学意义。且模型组中MAP-2的表达量较正常组低，差异有统计学意义。NBQX治疗组，3天、7天、14天表达量呈上升趋势，任意时间点两两比较脑组织中MAP-2的表达，差异有统计学意义；在7天、14天时，同一时间点高于模型组的表达量，低于正常组的表达量，差异有统计学意义。
　　结论：
　　1.早产兔发生GM-IVH后，脑组织中MBP的表达降低，提示GM-IVH后影响少突胶质细胞的成熟及髓鞘化进程。给予NBQX治疗后，在一定程度上MBP的表达升高，提示NBQX干预有助于少突胶质细胞发育，改善预后。
　　2.早产兔发生GM-IVH后，脑组织中MAP-2的表达降低，提示GM-IVH后破坏神经元树突结构完整性。给予NBQX治疗后，在一定程度上MAP-2的表达升高，提示NBQX治疗后神经元树突结构相对完整，可能对神经元功能起到修复作用。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 实验材料

2 GM-IVH动物模型的制作及分组

3 动物安乐死与标本取材

4 脑组织切片的制作

5 HE染色

6.免疫组化检测微管相关蛋白-2（microtubule associated protein-2，MAP-2)的表达操作流程

7.用蛋白印迹检测方法检测髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein,MBP）的表达

8 统计学处理

结果

1 成功复制了早产兔GM-IVH动物模型。

2 用蛋白印迹（Western blot）实验方法检测脑组织中MBP的表达

3 应用免疫组化检测脑组织中MAP-2的表达

附图

附表

讨论

1 GM-IVH后MAP-2的表达以及NBQX的作用

2 GM-IVH后MBP的表达以及NBQX的作用

3 本实验的局限性

4 结语

结论

参考文献

综述:脑室内出血的病理机制及研究现状

致谢

个人简历