拟南芥质膜定位的4个推测的钙调素结合蛋白的分析验证

摘要

在植物中，我室和其他实验室的研究结果表明，钙调素(calmodulin，CaM)，这一类传统上被认为细胞内重要的Ca2+传感蛋白，在细胞外也是广泛存在的，并且发挥着非常重要的生物学功能。根据这些实验结果，我室提出了细胞外钙调素可能是一种植物多肽信使的观点，并且建立了细胞外钙调素信号转导机制的假设模型。依据该模型，细胞外钙调素与存在于细胞外或质膜上的受体结合，进而激活下游信号通路，最终调节植物的生理功能及基因表达。最近，Cui等人利用35S标记CaM的方法，证明了拟南芥悬浮培养细胞和原生质体表面存在着细胞外CaM受体样结合蛋白。但是，细胞质膜上与钙调素结合的蛋白是什么，并不清楚，为此，进行了以下的实验来研究拟南芥细胞膜上和钙调素结合的蛋白质。 我室前期工作首先提取了拟南芥悬浮培养细胞的微粒体膜蛋白，其次利用钙调素亲和层析及质谱分析，从抽提蛋白中，纯化鉴定得到了35种蛋白，并且通过生物信息学分析的方法，对这些蛋白质的性质进行了简单的描述，然后瞬时转化洋葱表皮细胞，荧光显微镜观察表明，其中有5种蛋白质在质膜有明显的分布。 但是，这些蛋白质在植物体内是否和钙调素结合，还需要通过其他实验手段来进一步证明。为此本实验首先利用酵母双杂交和荧光共振能量转移的技术对这些候选蛋白和钙调素的相互作用进行了进一步的验证。酵母双杂交结果表明，4个候选蛋白质PCaMBPl、PCaMBP2、PCaMBP3、PCaMBP4都可以和钙调素发生相互作用。但是采用洋葱表皮细胞瞬时共表达系统，荧光共振能量转移分析，只证实其中的PCaMBP4可以和钙调素结合。 另外，本实验还对一些拟南芥T-DNA插入突变体进行了DNA水平的初步筛选。

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论文说明：缩写表

声明

1文献综述

1.1植物细胞膜上钙调素结合蛋白的研究意义

1.2植物中已经报道的质膜上钙调素结合蛋白的种类和生物学功能

1.2.1 Ca2+ATPase

1.2.2离子通道

1.2.3 Mlo蛋白

1.3钙调素结合蛋白质的钙调素结合域的结构特性

1.4植物质膜上钙调素结合蛋白的常用的生化研究方法

1.4.1蛋自质的亚细胞定位研究的方法

1.4.2常用的鉴定某种蛋白质为钙调素结合蛋白质的研究方法

2研究论文：拟南芥质膜定位的4个推测的钙调素结合蛋白的分析验证

2.1材料及试剂

2.2实验方法

2.2.1生物信息学分析

2.2.2基因枪瞬时转化洋葱表皮细胞

2.2.3目的片段的扩增、DNA琼脂糖电泳及片段回收

2.2.4酵母感受态的制备及转化

2.2.5酵母双杂交泛素系统载体构建

2.2.6酵母双杂交

2.2.7 X-Gal filter

2.2.8 β-galactosidas活性的定量测定

2.2.9质粒的提取

2.2.10激光共聚焦观察及FRET图像采集

2.2.11 FRET参数A、D值的计算

2.2.12 Net FRET的计算

2.2.13 FRET数值的统计学分析和FRET图像的处理

2.2.14拟南芥的种植

2.2.15植物材料基因组DNA的小量提取

2.3结果与分析

2.3.1生物信息学的分析

2.3.2推测的钙调素结合蛋白的亚细胞定位

2.3.3酵母双杂交泛素系统验证推测的钙调素结合蛋白与钙调素的互作

2.3.4 FRET验证推测的钙调素结合蛋白与钙调素的互作

2.3.5 At3g43500的T-DNA插入基因突变体筛选

2.4讨论

结论

参考文献

个人简历

致谢

攻读学位期间取得的科研成果清单