豫谷一号BAC文库的构建及鉴定

摘要

谷子(Setaria italica Beauv.)，是世界上最古老的农作物之一，并且作为一种重要的粮食作物，在我国北方的粮食生产中占有重要地位。谷子具有多种优良的农艺性状，目前已经证实的性状如耐旱、耐贫瘠等。随着人们对更高水平生活的追求，各种营养要素的均衡成为对食品的新的要求。谷子含人体所需的多种氨基酸，最为重要的一点是其所含的不饱和脂肪酸的含量很高，而这有正好是人体智力发育不可或缺的重要营养成分。我国谷子育种研究起步较晚，它的遗传研究相对落后，许多重要性状的基因有待开发。分子标记辅助育种技术，是现在农业技术发展的趋势，而获得优良农艺性状的基因是这一技术的核心要求。一般来讲现在获得目标基因主要采取图位克隆的策略。图位克隆目的基因一般由基因遗传图谱的构建、物理图谱的构建、高通量精细图谱的构建、染色体登陆或步移、基因的鉴定五个要素组成。而这其中的关键技术染色体步移，需要大量的基因组DNA片段作为基础。而BAC文库正承担了这一重要的角色。因此构建谷子的分子生物学技术平台就显得十分重要，而基因组文库正是这一平台的核心。豫谷一号是我国自主育成的优良品种，在组织培养、遗传学研究的三体构建具有优势，美国的谷子基因组测序也采用豫谷1号，所以以其作为原始材料构建BAC文库有着十分重要的现实意义。 本研究参考了前人关于TAC文库及BAC文库的构建方法，建立了自己的一套BAC文库的构建体系。包括：从幼嫩的叶片中获得高分子量的DNA、大量最佳部分酶切条件的确定、片段大小的选择、高效的连接与转化体系等。最终获得了一套转化效率高，重组率低，空载率低的BAC文库构建体系。由于BAC文库的构建相当费时费力，其试验的周期很长，且花费很大，因此每一步的试验都要精益求精。在这一系列的步骤中第一步细胞核的提取及包埋最为关键的，它直接影响到后续工作的成败。 利用所构建的体系，以peBloBAC11为载体，构建了豫谷一号的BAC文库，到目前为止获得了36096个克隆，并以单克隆的形式组装保存。从所构建的文库中随机挑取50个克隆用减裂解法提取质粒，脉冲电泳进行检测空载率为5％，重组克隆率为98％。平均插入片段大小为75kb，覆盖谷子基因组约4-5倍。本BAC文库的构建，是世界上第一个谷子基因组文库，为谷子基因组的深入研究提供了基础，尤其是谷子基因组测序即将完成，谷子功能基因组研究的时代即将到来的现在，本文库的构建是谷子功能基因发掘的物质基础，也将极大促进禾谷类作物比较遗传学的深入发展。

目录

文摘

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声明

引 言

1 文献综述

1.1谷子的经济意义及其研究

1.2谷子研究的分子生物学概况

1.2.1谷子分子标记的开发及相关研究进展

1.2.2遗传图谱的构建

1.2.3基因定位

1.2.4谷子与其它禾谷类作物的比较遗传学研究

1.2.5谷子品种鉴定及遗传进化研究

1.3 常用的目的基因克隆技术

1.3.1通过已知基因产物的分析鉴定

1.3.2通过遗传表型分析

1.3.3 以图谱为基础的定位克隆技术

1.4大片段DNA插入文库

1.4.1 lamda噬菌体文库

1.4.2 Cosmid文库

1.4.3 YAC文库

1.4.4 PAC文库

1.4.5 BAC文库

1.5本论文的立题依据

2.实验材料与方法

2.1 实验材料及药品的准备

2.1.1试验材料的准备

2.1.2 BAC载体的选择

2.1.3感受态细胞的选择

2.1.4配制试剂

2.1.5试验所用仪器

2.2实验方法

2.2.1 大分子量核DNA的提取

2.2.2胶块的制备

2.2.3胶块质量的鉴定

2.2.4部分酶切最佳酶用量的确定

2.2.5大片段DNA的大量酶切

2.2.6酶切DNA片段的第一次选择

2.2.7大片段DNA的二次选择

2.2.8大片段DNA的回收

2.2.9大片段DNA与载体的连接

2.2.10连接产物的电转化

2.2.11 BAC质粒的提取及鉴定

2.2.12 BAC文库的装备

3.结果与分析

3.1 高分子量DNA的制备

3.2酶切条件的确定

3.3大量酶切DNA的第一次片段选择的结果

3.4对所回收片段的二次选择

3.5回收片段的定量

3.6 转化结果

3.7克隆平均插入片段大小的分析

3.8装配文库

3.9插入片段的稳定性分析

4. 讨论

4.1 HWMDNA制备的方法探讨

4.2影响连接效率的因素及库及最佳片段选择的探讨

4.3 BAC文库构建所需感受态细胞的优化选择

4.4影响转化效率因素的研究

参考文献

附录

致谢