松材线虫sod基因的克隆及其亲缘关系的探讨

摘要

超氧化物歧化酶(sod)基因是生物体重要的基因之一。Sod消除氧化还原反应中产生的超氧化物,避免细胞因过氧化而损伤衰老。Sod基因在进化上具有较高的保守性,而这种保守性又反应出sod对于生物体的重要性。国内外学者已对许多动物的sod基因进行了研究,但有关松材线虫的sod基因的研究到目前为止还未见报道。因此,本实验对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的sod基因进行初步的研究,并探讨了松材线虫sod基因的特点和进化关系,所得结果如下。
　　 1.松材线虫sod基因的克隆
　　 本实验参照秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)sod3基因(NM078363.5),利用Primer Premier5软件设计引物,扩增松材线虫的sod基因,经过对RT-PCR产物纯化,并用pEASY-T1克隆载体对目的片段进行克隆和测序得到长度为296bp的核酸片段,该片段编码98个氨基酸残基。将该序列与秀丽隐杆线虫的sod3基因的核酸序列和氨基酸序列在GenBank上比对,核酸序列相似性达到70％以上,氨基酸序列相似性达到75％以上,确定克隆的核酸序列确实是sod基因部分序列。
　　 2.松材线虫sod基因片段亲缘关系的探讨
　　 将扩增的核酸序列在NCBI上进行检索,筛选出相似程度较高的属于26个物种的40个核酸序列。利用MEGA5.03软件对上述序列和克隆的松材线虫的sod核酸序列及其编码的蛋白质序列进行分析,计算遗传距离,采用邻接法(Neighor-Joining method,NJ法)和最大简约(Maximum Parsimonymethod,MP法),以海葵(Nematostella vectensis)为外群(out group)构建系统树,对松材线虫的sod基因与其他物种的sod基因进行亲缘关系分析。
　　 利用核酸和氨基酸序列分别构建的系统树得到基本一致的结果:系统树大体分为了3个主支,一支为原口动物(protostome)包括线虫动物门,星虫动物门和节肢动物门；另两支为后口动物(deuterostome),一枝为棘皮动物,另一枝为脊索动物。说明sod可以反映动物的亲缘关系。
　　 克隆的sod基因与其他线虫的sod基因在同一进化分支中,证明该sod基因片段确实属于松材线虫sod基因。
　　 从4个系统树上看到,同一类群动物的sod基因首先聚类在一起,然后再与其它类群动物的sod基因聚类,表明sod家族的基因有可能是来源于同一个祖先。

目录

文摘

英文文摘

文献综述

1.概述植物线虫的特点和危害性

2.分子生物学技术在线虫基因功能研究中的应用

2.1 RT-PCR技术

2.2 免疫荧光技术

2.3 基因芯片

2.4 RNA干扰

3.植物寄生线虫主要基因功能的研究进展

4.植物寄生线虫研究展望

正文部分

1.引言

2.材料与方法

2.1 虫体材料的培养和收集

2.2 试剂

2.3 溶液配制

2.4 仪器

2.5 松材线虫RNA的提取实验

2.6 RNA检测

2.7 RT-PCR实验

2.8 TA克隆

2.9 快速检验阳性重组子

2.10 菌体PCR法检验克隆片段

2.11 DNA测序和分析

2.12 sod基因的亲缘关系的分析

3.实验结果

3.1 松材线虫sod基因的克隆和序列分析

3.2 松材线虫部分sod序列基因亲缘关系的分析

4.讨论

结论

参考文献

致谢