抗氧化剂和自噬抑制剂对肺泡Ⅱ型细胞分化的影响

摘要

近年来，由于空气污染和寿命的延长，呼吸系统疾病呈高发趋势，慢阻肺、肺癌等严重肺部疾病已成为健康的重大隐患之一。已有证据表明，向大鼠静脉内注入间充质干细胞能修复受损的肺组织。因此，应用干细胞或诱导干细胞等新方法修复受损肺组织的研究，为重度肺病患者带来福音。如所周知，肺泡II型细胞（ATⅡ细胞）是哺乳动物肺泡上皮的主要组成部分，其不但有合成和分泌肺泡表面活性物质以维持肺表面张力、调节水盐平衡以维持肺环境渗透压、合成免疫效应物分子来抵御有害抗原物质对肺部的侵袭作用，还作为肺部的干细胞，具有修复急/慢性肺损伤，迁移并转化形成ATⅠ细胞，维持肺部内稳态的重要功能，在受损肺上皮的修复中起着极其关键的作用。所以，ATⅡ细胞的原代培养、向 ATⅠ细胞分化的机制及相关模型的研究，就成为揭示肺部疾病的发病机理及探寻防治途径的基础，具有重要的理论和实际意义。 把活体肺组织中分离的ATⅡ细胞而非相关肿瘤细胞作为模型是该领域研究的关键环节之一。早在1974年，Kikkawa和 Yoneda就建立了啮齿类动物的ATⅡ细胞的分离方法，现在已能分离和培养家兔、仓鼠、人、豚鼠、小鼠、牛等原代ATⅡ细胞。但后继的研究发现，离体的ATⅡ细胞在一般的培养条件下，其分裂增殖和维持细胞特性仅有几天，随后就停止分裂，并表达ATⅠ细胞的特征性标志蛋白，分化成ATⅠ细胞，失去ATⅡ细胞的特性。尽管在培养基中分别添加了不同因子，如干细胞生长因子，也未能使上述情况得到改善。也有许多研究者，将诸如A549、L2、MLE12等具有一定ATⅡ细胞特性的来源于肺癌组织的细胞株作为模型进行研究，但这些细胞无论在形态结构还是功能特性上都与ATⅡ细胞有着较大差异。所以，探讨维持离体ATⅡ细胞的分裂增殖和细胞特性的培养方法和机制，就成为打破ATⅡ细胞相关研究的瓶颈的关键问题。 在其它干细胞的研究中发现，氮乙酰半胱氨酸（NAC）、维生素C（Vc）、褪黑素等还原剂类物质能有效地阻止干细胞分化，维持干细胞的特性。近年来细胞自噬的研究表明，自噬对干细胞的分化具有重要影响。例如，2014年发现了自噬相关基因Atg5在神经干细胞分化为神经胶质细胞的过程中起着关键的调控作用，与人脑的发育密切相关；2015年报道了调节细胞增殖的wnt/β-catenin信号通路受自噬的负性调节，参与了ATⅡ细胞的分化。这些研究结果提示，抗氧化剂和自噬抑制剂可能具有阻抑干细胞分化、维持干细胞特性的作用。由此，作者设想在原代ATⅡ细胞的培养基中分别加入不同的抗氧化剂和自噬抑制剂可能对维持其干细胞特性有积极的作用。从现有的文献中，未见该设想的研究报道，值得进行更深层次的研究。 为此，本课题拟以原代培养的成年健康雄性SD大鼠的ATⅡ细胞为研究对象，以弹性蛋白酶酶解，用差速贴壁法、IgG包被培养板法分离并纯化大鼠的ATⅡ细胞；台盼蓝法检验ATⅡ细胞的活性；以碱性磷酸酶染色法、透射电镜技术检测ATⅡ细胞的纯度；以自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）转染原代大鼠ATⅡ细胞，确定最佳转染滴度后，于Incucyte中培养并观察ATⅡ细胞分化过程中自噬的变化情况；采用Incucyte活细胞动态成像系统动态观察以及免疫组织化学染色的方法研究NAC、谷胱甘肽、褪黑素等还原剂类物质以及自噬相关抑制剂对原代培养大鼠ATⅡ细胞分化过程的影响，以期为解决上述问题提供基础研究资料。 所得实验结果如下： 1.本实验成功分离纯化了大鼠ATⅡ细胞。 2.在原代培养的ATⅡ细胞向ATⅠ细胞的分化过程中存在着明显的自噬现象。 3.添加NAC（50μM）、谷胱甘肽（500μM）以及褪黑素（10μM）的完全培养基，不利于原代培养的ATⅡ细胞的生长与增殖。 4.与空白对照组相比，添加自噬抑制剂3-MA（25μM）的完全培养基则有利于原代培养的ATⅡ细胞表型的维持。 通过对上述实验结果的分析，得出如下结论： 1.原代培养的ATⅡ细胞分化过程中存在着明显的自噬现象。 2. NAC、谷胱甘肽以及褪黑素等还原性物质，不利于原代培养的ATⅡ细胞的生长与增殖。 3.自噬抑制剂3-MA可以在一定程度上维持原代培养的ATⅡ细胞的表型。

目录

声明

引言

1 综述 肺上皮干细胞的研究进展

1. 肺上皮细胞类型

2. 肺上皮干细胞类型及其相关标志物

3. 肺泡上皮细胞与肺损伤

4. ATⅡ 细胞与肺损伤修复

5. 肺泡上皮干细胞与诱导性多能干细胞

6. 展望

2 实验一 SD大鼠ATⅡ 细胞的提取、分离及鉴定

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

3 实验二 不同抗氧化剂对原代培养ATⅡ 细胞生长状态的影响

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

4 实验三 原代培养ATⅡ 细胞分化过程自噬的变化情况

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

5 实验四 自噬抑制剂3-MA对原代培养ATⅡ 细胞的影响

5.1 材料与方法

5.2 实验结果

6 讨论

7 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间取得的科研成果清单