嗜热酯酶Est11的克隆表达、酶学性质及其在糖酯合成中的应用研究

摘要

酯酶（carboxylesterases，carboxyl ester hydrolases，EC3.1.1.1）可催化酯交换、酯合成、多肽合成和内酯合成等多种反应，在食品、化工和环保等领域发挥着重要作用。嗜热酯酶与常温酯酶相比，表现出较强的热稳定性和抗有机溶剂等性能，因此在生物催化合成等领域极具应用潜能。本研究首先将来自嗜热古菌海栖热胞菌MSB8（Thermotoga maritima MSB8）中表达酯酶的基因 Tm1350在大肠杆菌中克隆表达，得到嗜热酯酶Est11，然后对嗜热酯酶Est11的酶学性质进行研究，最后对该嗜热酯酶Est11在催化合成糖酯方面进行了探究。
　　具体实验结果如下：
　　（1）生物信息学分析表明，T.maritima MSB8全基因组中Tm1350酯酶基因全长为780 bp，对应编码259个氨基酸。利用Blast软件找到氨基酸同源序列，并利用同源序列分析软件Clustal W对其保守结构域和位点进行分析，结果发现Ser103、Asp183和His249可能是Tm1350酯酶的催化活性中心。
　　（2）采用重叠 PCR方法克隆嗜热酯酶基因 Tm1350，成功构建重组质粒pET15b-Tm1350，将重组质粒pET15b-Tm1350转化至Escherichia.coli BL21感受态细胞中构建宿主工程菌，重组基因工程菌E.coli BL21经IPTG诱导能够稳定表达目的蛋白酶Est11，SDS-PAGE结果显示该目的蛋白Est11分子量约28 KDa，镍柱亲和层析纯化法所得Est11纯化回收率达到27.13％，Est11比活力为993.05 U/mg。
　　（3）嗜热酯酶Est11的酶学性质研究表明：（a）酯酶Est11的最适作用温度和最适pH分别为70℃和6.5。酯酶Est11具有较高的热稳定性，90℃高温下处理5 h仍有60%以上的残余酶活。（b）底物特异性分析表明嗜热酯酶Est11适宜水解碳链长度小于10的对硝基苯酚酯，且其最适水解底物为pNP-C5。（c）0.5 mM金属阳离子螯合剂EDTA、Ba2+和Mg2+对嗜热酯酶Est11酶活性无显著影响；Na+和K+能将嗜热酯酶Est11的酶活性提高约20%；Ni2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+和Pb2+使嗜热酯酶Est11酶活性降低约50%；Cu2+明显抑制嗜热酯酶Est11的酶活，使其酶活力仅剩14%；Al3+则完全抑制嗜热酯酶Est11酶活性。（d）该嗜热酯酶Est11具有较强的抵抗有机溶剂能力，Est11在90%的DMSO、甲醇、乙醇等有机溶剂体系中处理2 h，酶活性无明显变化，而在90%的叔戊醇、氯仿、二氯甲烷等有机溶剂体系中仍有约50%酶活。（e）嗜热酯酶Est11在离子液体中酶活性降低，如在50%离子液体N-辛基-4-甲基吡啶四氟硼酸盐中处理2 h酶活性仅剩60%。（f）SDS、Tween-20等对嗜热酯酶Est11酶活性无显著影响。5 mM DTT和PMSF使嗜热酯酶Est11酶活性分别降为原来的13%和51%，5 mM DEPC则完全抑制Est11酶活性。（g）傅里叶红外吸收光谱测定发现，Est11经有机溶剂或离子液体处理后酶活性的变化与其二级结构中α-螺旋和β-折叠的变化密切相关。
　　（4）嗜热酯酶Est11在高温条件下能够催化葡萄糖和乙酸酐发生酯化反应生成五乙酸葡萄糖酯，初步显示出嗜热酯酶Est11在催化合成糖酯方面的应用潜力。

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第一章 绪论

1.1 嗜热菌的研究现状

1.2 微生物酯酶的应用与开发

1.3 糖酯合成研究现状

1.4 本课题立题意义及研究内容

第二章嗜热酯酶Est11（Tm1350）在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章嗜热酯酶Est11酶学性质研究

3.1 引言

3.2 实验材料

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第四章嗜热酯酶Est11催化合成糖酯应用研究

4.1 引言

4.2 实验材料

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

致谢

参考文献

附录Ⅰ 溶液的配制

附录Ⅱ 攻读硕士学位期间发表的论文