高温酵母的分离鉴定及原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母

摘要

从来源不同的基质中共分离得到227株耐高温酵母菌,经初筛、复筛和酒精发酵试验,获得一株耐高温且具有一定产酒精能力的酵母菌株h-1,其在42℃下72小时发酵,酒精产率为5.5％.研究了h-1的形态和生理生化特性,结果表明:h-1菌株产生1-4个土星行子囊孢子,该菌株发酵葡萄糖、蔗糖,弱发酵棉籽糖,不发酵麦芽糖、半乳糖,乳糖;同化棉籽糖、纤维二糖、木糖、柠檬酸、琥珀酸、蔗糖,不同化肌醇、核糖、赤藓糖醇、鼠李糖、核糖醇、甘露醇、可溶性淀粉、阿拉伯糖、海藻糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖;不能同化硝酸盐;可在无维生素培养基上生长;37℃下可生长.根据《The Yeast》(第三版),鉴定h-1菌株属于的土星汉逊酵母(Hansenula Saturnus).选择化学药物和紫外灭活单亲原生质体为遗传标记,测定了放线菌酮、三唑酮、多菌灵、灰酶特杀、决菌、霜霉狂杀对h-1和酿酒酵母SP-48的抑制作用,结果表明只有0.01%的三唑酮可以抑制SP-48,而不抑制h-1,选择0.01%的三唑酮作为药物标记.测定了紫外照射剂量和h-1原生质体致死率的关系,当紫外灯为20瓦,照射距离为30cm,照射时间为2分钟时,h-1原生质体的致死率为100%.因此,以0.01%的三唑酮和紫外照射h-1原生质体2分钟为遗传标记.采用PEG法将h-1酵母与不耐高温的高产酒精酵母SP-48进行原生质体融合,获得既耐高温酒精产率又较高的融合子LZ-3,LZ-3 72小时发酵,酒精产率为7.5%.融合子LZ-3遗传性状稳定,传代20次后,融合子LZ-3的酒精产率和初代相比没有明显变化.确定了融合子LZ-3生长和发酵的最适温度和pH值;研究了温度、pH值和接种量对生长和发酵曲线的影响;测定了融合子LZ-3的耐酸碱;耐酒精;耐盐;耐糖和耐发酵副产物特性.结果表明:融合子LZ-3的最适生长温度为36℃,最适生长pH为5;最适发酵温度为34℃,最适发酵pH为5;温度和接种量对生长和发酵曲线的影响显著,pH对生长和发酵曲线的影响不显著;耐酒精能力为20%(v/v);耐盐能力为11%;可在50%(w/w)的葡萄糖溶液中发酵;对乙酸、乳酸和甘油有一定的耐受能力.采用四因素三水平正交试验确定了融合子LZ-3的浓醪酒精发酵工艺.浓醪发酵的最佳工艺条件是:料水比为1:2,糖化酶用量为400IU/g原料,接种量为9%(v/v),初始pH值为5.5,在此条件下,以玉米粉的糖化醪为培养基,发酵72小时,LZ-3的酒精产率为9.0%.

目录

文摘

英文文摘

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缩略词表

1引言

1.1酒精工业的发展前景

1.2酒精发酵的菌种及发酵机理

1.3酒精生产的原料及育种研究进展

1.3.1酵母可利用原料现状

1.3.2育种研究与拓展酒精生产原料

1.4高产酒精酵母育种研究方法及进展

1.4.1传统育种技术

1.4.2现代育种技术

1.5耐高温酵母的耐热特性

1.5.1脂肪酸组成的变化与酵母菌耐热性的关系

1.5.2磷脂与酵母耐热性的关系

1.5.3麦角固醇与酵母耐热能力的关系

1.6原生质体融合的研究现状

1.7小结

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1酵母菌分离源

2.1.2试验菌种及来源

2.1.3培养基

2.1.4主要仪器设备

2.2方法

2.2.1酵母分离样品的采集

2.2.2酵母菌的分离

2.2.3酵母菌的筛选

2.3酵母菌的鉴定

2.3.1形态与培养特征：

2.3.2生理生化试验

2.4酵母菌的融合

2.4.1遗传标记的选择

2.4.2原生质体的制备

2.4.3原生质体再生率测定

2.4.4原生质体的融合

2.4.5融合子的检出

2.4.6融合子的初筛

2.4.7融合子的复筛

2.4.8融合子的初步鉴定

2.4.9融合子的稳定性试验

2.5融合子基本生理特性的研究

2.6融合子发酵工艺的正交试验

2.6.1α-淀粉酶用量试验

2.6.2融合子LZ-3酒精发酵工艺优化试验

3结果与分析

3.1酵母菌的分离

3.2酵母菌的筛选

3.2.1酵母菌的一级筛

3.2.2酵母菌二级筛

3.2.3酵母菌三级筛

3.3酵母菌的鉴定

3.3.1亲本h-1菌株的形态和培养特征

3.3.2生理生化试验

3.4酵母菌的原生质体融合

3.4.1遗传标记的选择

3.4.2原生质体的制备

3.4.3原生质体再生率测定

3.4.4原生质体的融合

3.4.5融合子的检出：

3.4.6融合子的初筛

3.4.7融合子的复筛：

3.4.8融合子的初步鉴定：

3.4.9融合子的稳定性试验

3.5融合子基本生理特性的研究

3.5.1不同因素对生长曲线的影响研究

3.5.2不同因素对发酵曲线的影响研究

3.5.3融合子LZ-3的耐酒精、耐酸碱、耐糖及耐盐特性研究

3.5.4融合子LZ-3耐发酵副产物特性研究

3.6融合子LZ-3酒精酿造工艺的研究

3.6.1 α-淀粉酶用量试验

3.6.2融合子LZ-3酒精发酵工艺优化试验

4讨论

4.1酵母菌筛选与鉴定

4.1.1酵母菌分离

4.1.2酵母菌鉴定

4.2酵母菌的融合

4.3融合子LZ-3的生理特性

4.3.1生长与发酵温度

4.3.2生长与发酵pH值

4.3.3代谢副产物对酵母抑制作用

结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢