环介导等温扩增技术快速检测转基因大豆研究

摘要

由于转基因植物存在的安全性问题使得转基因农作物的标签问题成为公众关注的主要热点，已有30多个国家制定了相应的法律法规对转基因作物及其衍生产品进行标签。目前，许多未经标签和认证的转基因大豆已经进入中国市场，这就迫切地需要合适的检测手段以确定这些大豆中是否含有转基因成分。
　　 传统的检测转基因大豆的方法操作繁琐、检测时间较长，通常需要5～7d 才能完成且检出限较低，不能满足现代检测的需要。所以急需建立灵敏、可靠、快速的转基因大豆检测方法。
　　 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温条件（65℃左右）下进行扩增。可以在1 h之内，将靶DNA片段扩增109～1010倍。因此，LAMP技术终将会在检测领域中广泛应用。
　　 本研究针对转基因大豆的特异基因CP4-EPSPS(GenBank accession numberAY5966948）设计引物，用LAMP 引物在线设计引物软件设计引物。并对反应温度、反应时间、镁离子浓度、Bst DNA 聚合酶浓度等扩增条件进行优化，建立LAMP 反应体系。
　　 LAMP反应体系如下：F3与B3（LAMP反应外引物）各5 pmol；BIP与FIP(LAMP反应内引物）40 pmol；其它反应组分终浓度分别为：1.0 mmol/L dNTP，1.0 mmol/LBetaine,4.0 mmol/L MgSO4,2.5 μL Bst DNA聚合酶缓冲液（20 mM Tris-HCl(pH8.8,25℃)，10 mM KCl，10 mM(NH4)2SO4,2 mM MgSO4，0.1％Triton X-100），0.4 μL BstDNA聚合酶，1.5μL目标DNA，纯水补足体积到25μL。扩增反应条件为61℃保存1 h,80℃ 2 min使酶灭活。LAMP反应产物在1 ％的琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统观察结果，产生预期的梯形条带。
　　 另外，对不同样品分别进行了PCR 反应和LAMP 反应来验证引物的特异性，结果表明：转基因大豆为阳性结果，其它样品均为阴性结果。采用CTAB 方法制备模板进行PCR和LAMP 反应，其方法的检出限分别为0.2％和0.01％，LAMP 方法的检出限是PCR的20倍。LAMP 扩增可在60 min 内完成，对转基因大豆的检测的整个检测过程（包括DNA 提取60 min、LAMP 反应60 min和电泳30 min）可在2.5 h 内完成。如在LAMP反应结束后的产物中加入SYBR Green I 荧光染剂，通过混合液的颜色可直接判断扩增发生与否，整个检测时间可在2 h 内完成，初步建立了转基因大豆的LAMP 检测方法。
　　 总之，LAMP 检测方法的灵敏度高、特异性好、耗时短，为转基因作物快速检测构建了良好的技术平台。

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1 引言

2 材料与方法

3 结果与分析

4 讨论

5 结论

参考文献

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