环介导等温扩增(LAMP)技术检测幃类中副溶血弧菌的研究

摘要

副溶血性弧菌是我国一种重要的食源性病原菌,可引起急性肠胃炎,少数情况还能引发败血病,危及生命。副溶血性弧菌引起的疾病已成为我国一个严重的食源性公共卫生问题之一,该菌引发的疾病居微生物性食源性疾病暴发之首,目前发病人数呈显著上升趋势。特别在沿海地区,发病起数和涉及人数较我国其它地区更为严重,因此,必须建立可靠的快速检测方法,持续地进行水产品中副溶血性弧菌的主动监测和污染控制。目前对副溶血性弧菌的检测方法主要有传统的分离鉴定方法,免疫学方法和分子生物学检测方法等。传统检测方法操作繁琐,检测时间长,而且灵敏度较低；免疫学方法的特异性和灵敏度也不理想;PCR方法敏感、快速,但由于需要昂贵的仪器设备、繁琐的电泳过程,而使其难以在基层普及和推广。2000年,Notomi等开发出一种新的核酸扩增技术,环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP),该技术以其灵敏度高、特异性强、快速、操作简便、检测成本低等优点在病毒、真菌、细菌以及转基因食品的检测中得到应用。因此,建立LAMP技术检测副溶血弧菌对于控制副溶血弧菌的食物中毒具有重要意义。
　　 本文以副溶血弧菌具有种特异性的gyrB基因为靶基因(基因号AY527390),应用在线引物设计软件(https:／／primerexplorer.jp／lamp3.0.0／index.html)设计LAMP引物建立环介导等温扩增方法检测贝肉中的副溶血弧菌。对反应时间、反应温度、镁离子浓度等扩增条件进行优化,确定25μL的LAMP反应体系为:内引物(FIP和BIP)各1.6μmol／L,外引物(F3和B3)各0.2μmol／L,环引物(LF和LB)各0.8μmol／L,0.6mmol／LdNTP,2mmol／L Mg2+,2.5μL10×Bst DNA聚合酶反应缓冲液,8u的Bst DNA聚合酶大片段,1μL DNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。LAMP反应过程是首先在65℃水浴锅中反应40min,然后将其放入80℃水浴锅中,水浴5min终止反应,通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀,即可判断是否发生了LAMP反应,亦可通过琼脂糖凝胶电泳证实反应是否发生。本研究对13株副溶血弧菌、14株弧菌属菌株和19株非弧菌属菌株作对照,验证方法特异性,结果表明,13株副溶血弧菌检测结果为阳性,其他33株菌株为阴性。初步研究了6种从人工污染副溶血弧菌的贝肉中提取模板DNA的方法,结果表明,LAMP对制备模板DNA方法的要求不高。本研究对LAMP法快速检测副溶血弧菌进行了研究,确定了检测纯培养物的灵敏度,人工污染检出限,并与普通PCR检测方法进行了对比。结果表明:LAMP检测副溶血弧菌纯培养物的灵敏度为19CFU／mL,人工污染副溶血弧菌的贝肉检出限为87CFU／g。采用试剂盒提取DNA,从样品处理到报告结果,耗时2h。而对照,PCR检测副溶血弧菌纯培养物的灵敏度为1900CFU／mL,人工污染副溶血弧菌的检出限为8700 CFU／g。采用同样方法提取DNA,从样品处理到报告结果,耗时4 h。模拟贝肉样品含副溶血弧菌1CFU／g,样品经增菌2h后即可检出,检测周期4h,将本方法与行业标准GB／T4789.7-2008方法进行比较,确定LAMP方法敏感性为100％,特异性为98.72％,符合率为98.84％。研究表明,LAMP技术灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单,为快速检测贝类中副溶血弧菌构建了一个技术平台。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

1.1 立题背景及目的

1.2 副溶血弧菌简介

1.2.1 副溶血弧菌生物学性状

1.2.2 副溶血弧菌的流行病学特征

1.2.3 副溶血弧菌的毒力因子

1.3 副溶血弧菌检测方法研究现状

1.4 环介导等温扩增(LAMP)技术概述

1.4.1 LAMP的特点

1.4.2 LAMP方法的引物设计

1.4.3 LAMP反应原理

1.4.4 LAMP反应产物的检测方法

1.4.5 LAMP方法的应用

1.5 研究内容

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验菌株

2.1.2 仪器与设备

2.1.3 主要培养基

2.1.4 样品与生化试剂

2.2 试验方法

2.2.1 副溶血弧菌培养

2.2.2 副溶血弧菌基因组DNA的提取

2.3 引物设计和操作程序

2.3.1 LAMP引物设计

2.3.2 LAMP和PCR操作程序

2.4 PCR反应条件的优化

2.5 LAMP反应条件优化

2.5.1 反应温度的优化

2.5.2 适宜Mg2+浓度选择

2.5.3 dNTPs浓度的优化

2.5.4 Bst酶的优化

2.5.5 引物对LAMP反应的影响

2.5.6 甜菜碱对LAMP反应的影响

2.5.7 反应时间的优化

2.6 引物特异性的检测

2.6.1 LAMP引物特异性的检测

2.6.2 PCR引物特异性的检测

2.7 副溶血弧菌的灵敏度检测

2.7.1 LAMP检测副溶血弧菌基因组灵敏度

2.7.2 PCR检测副溶血弧菌基因组灵敏度

2.7.3 LAMP检测副溶血弧菌纯培养的灵敏度

2.7.4 PCR检测副溶血弧菌纯培养的灵敏度

2.8 LAMP扩增产物的分析

2.8.1 LAMP产物的可视结果分析

2.8.2 LAMP产物的凝胶成像分析

2.8.3 LAMP产物的荧光分析

2.8.4 LAMP产物酶切结果的分析

2.9 人工污染贝肉中副溶血弧菌基因组DNA提取方法比较

2.9.1 人工污染贝肉

2.9.2 试剂盒法

2.9.3 溶剂提取热裂解法

2.9.4 普通热裂解法

2.9.5 蛋白酶K法

2.9.6 FDA提取DNA法

2.9.7 苯酚-氯仿抽提法

2.10 人工污染贝肉的检出限

2.10.1 LAMP法检测人工污染副溶血弧菌样品的检出限

2.10.2 PCR的检出限

2.11 基于预增菌法LAMP检测副溶血弧菌

2.12 实际样品(贝肉)检测

3 结果与分析

3.1 LAMP反应条件的优化

3.1.1 引物的优化

3.1.2 Mg2+浓度的优化

3.1.3 dNTPs浓度的优化

3.1.4 Bst酶的优化

3.1.5 甜菜碱对LAMP反应的影响

3.1.6 反应温度的优化

3.1.7 反应时间的优化

3.1.8 LAMP反应的最佳反应体系

3.2 优化PCR反应体系结果

3.3 引物特异性的研究

3.3.1 LAMP引物特异性的研究

3.3.2 PCR引物特异性的研究

3.4 副溶血弧菌灵敏度的研究

3.4.1 LAMP检测副溶血弧菌的基因组灵敏度

3.4.2 PCR检测副溶血弧菌基因组灵敏度

3.4.3 LAMP检测副溶血弧菌的灵敏度

3.4.4 PCR检测副溶血弧菌的灵敏度

3.5 LAMP扩增产物的分析

3.5.1 LAMP扩增的可视结果分析

3.5.2 LAMP扩增产物的电泳分析

3.5.3 LAMP产物的荧光分析

3.5.4 LAMP扩增产物酶切鉴定

3.6 贝肉中副溶血弧菌DNA提取方法比较

3.7 人工污染贝肉检出限比较

3.7.1 LAMP检测贝肉中副溶血弧菌检出限

3.7.2 PCR检测贝肉中副溶血弧菌检出限

3.8 副溶血性弧菌阳性样品增菌培养

3.9 实际样品(贝肉)检测

4 讨论

4.1 环介导等温扩增(LAMP)方法检测副溶血弧菌方法学评价

4.2 环介导等温扩增(LAMP)引物的选择

4.3 LAMP体系优化

4.4 模板DNA的提取

4.5 增菌计数时间的选择

4.6 LAMP产物酶切电泳条件的选择

4.7 LAMP污染问题,原因,注意事项

4.8 预增菌LAMP检测

4.9 基因组检测灵敏度和纯菌检测灵敏度之间的差异

5 结论

参考文献

硕士期间发表学术论文

作者简介

致谢