TEM1型β-内酰胺酶免疫胶体金层析检测方法的建立

摘要

β-内酰胺酶是对β-内酰胺类抗生素耐药的细菌分泌的一种胞外酶,可选择性分解β-内酰胺类抗生素,是绝大多数致病菌对青霉素类药物产生耐药的主要因为。在牛奶中加入β-内酰胺酶后,能将β-内酰胺类抗生素全部降解,从而达到掩盖牛奶含有抗生素的目的。β-内酰胺酶在我国奶牛养殖和牛奶生产中很大程度上持续存在。因此,为确保牛奶及乳制品质量安全,保障消费者健康,建立牛奶中β-内酰胺酶的检测技术十分必要。牛奶中β-内酰胺酶的检测方法中微生物法灵敏度高,但检测时间较长；碘量法、高效液相色谱法等操作复杂,需要特殊的仪器设备。免疫胶体金层析法是一种快速、灵敏、特异和安全的检测技术,可以实现现场快速检测,为大规模筛选提供技术支持。
　　 本研究采用小鼠体内诱生法制备抗TEM1型β-内酰胺酶单克隆抗体,采用兔背部多点注射的方法制备抗TEM1型β-内酰胺酶的多克隆抗体。两种抗体经辛酸-硫酸铵法纯化后进行质量鉴定,单抗和多抗的蛋白质浓度分别为10mg／mL、6mg／mL。间接ELISA测得抗体效价分别为1:320000和1:80000。双抗夹心法结果表明两种抗体对TEM1型β-内酰胺酶的特异性较高,且对头孢菌素酶无交叉反应性。采用柠檬酸三钠还原法制备出质量高、直径20nm的胶体金颗粒,对多克隆抗体进行标记的最适蛋白量为72μg／mL,最适pH值以加入0.1mol／L K2CO3的体积衡量,为35μL。金标抗体经纯化后采用浸泡法吸附在Ahlstrom8964玻璃纤维素膜上。将抗TEM1型β-内酰胺酶的单抗包被在NC膜上作为检测线,羊抗兔二抗作为质控线,并对免疫层析试纸条的样品垫、NC膜、金标垫等材料筛选以及相关处理液进行了优化。分别经过处理干燥后与吸水纸、PVC板组装成试纸条。所制备出的试纸条对PBS基质和牛奶基质中的最小检出限为6U／mL和10U／mL,4℃可保存三个月。本研究对胶体金免疫层析检测TEM1型β-内酰胺酶进行了初步研究。采用双抗夹心法建立了TEM1型β-内酰胺酶的胶体金免疫层析方法,制备出快速检测试纸条,该试纸条灵敏度、特异性、稳定性均良好。

目录

文摘

英文文摘

基金项目

缩略词

第一章 引言

1.1 β-内酰胺酶概述

1.1.1 β-内酰胺酶的分类

1.1.2 牛奶中β-内酰胺酶的来源

1.1.3 牛奶中β-内酰胺酶的危害

1.1.4 牛奶中β－内酰胺酶的检测方法及研究现状[17]

1.2 胶体金免疫层析技术

1.2.1 胶体金的性质

1.2.2 免疫胶体金的制备

1.2.3 免疫胶体金层析技术的反应模式

1.2.4 免疫胶体金技术的特点

1.3 研究目的和意义

第二章 TEMl型β-内酰胺酶抗体的制备及鉴定

2.1 试验材料

2.1.1 主要试剂及材料

2.1.2 仪器和设备

2.1.3 主要溶液

2.1.4 试验动物及细胞

2.2 试验方法

2.2.1 抗TEM1型β-内酰胺酶单克隆抗体的制备

2.2.2 抗TEM1型β-内酰胺酶多克隆抗体的制备

2.2.3 抗TEM1型β-内酰胺酶抗体的纯化及鉴定

2.2.4 用间接ELISA法检测抗体效价

2.2.5 双抗夹心ELISA特异性测定

2.3 结果与分析

2.3.1 抗TEM1型β-内酰胺酶单克隆抗体的制备

2.3.2 抗TEM1型β-内酰胺酶多克隆抗体的制备

2.3.3 抗TEM1型β-内酰胺酶抗体的纯化及鉴定

2.3.4 用间接ELISA法检测抗体效价

2.2.5 双抗夹心ELISA特异性检测

2.4 讨论

2.4.1 单克隆抗体的制备

2.4.2 多克隆抗体的制备

2.4.3 抗体的纯化

2.4.4 双抗夹心ELISA的特异性检测

第三章 TEM1型β-内酰胺酶免疫层析方法的建立

3.1 试验材料

3.1.1 主要试剂及材料

3.1.2 仪器和设备

3.1.3 主要溶液

3.2 试验方法

3.2.1 胶体金的制备及鉴定

3.2.2 金标抗体的制备

3.2.3 免疫胶体金层析试纸条所用材料及处理液的确定

3.2.4 免疫胶体金层析试纸条的组装

3.2.5 免疫胶体金层析试纸条检测方法原理和结果判断

3.2.6 免疫胶体金层析试纸条性能检测

3.2.7 牛奶样品的处理

3.3 结果与分析

3.3.1 胶体金的制备及鉴定

3.3.2 金标抗体的制备

3.3.3 免疫胶体金层析试纸条所用材料及处理液的确定

3.3.4 免疫胶体金层析试纸条的组装和结果判断

3.3.5 免疫胶体金层析试纸条性能检测

3.3.6 牛奶样品的检测

3.4 讨论

3.4.1 胶体金的制备

3.4.2 金标抗体的制备

3.4.3 胶体金试纸条的组成材料的选择

3.4.4 各种处理液的影响

3.4.5 胶体金试纸条的组装

3.4.6 牛奶样品的处理

3.4.7 试纸条的灵敏度

3.4.8 牛奶样品的检测

结论

参考文献

在读期间发表论文

作者简介

致谢

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