牛奶中青霉素类药物多残留免疫检测方法研究

摘要

近年来，食品安全问题频发，消费者对食，品安全的关注日益增加。牛奶中残留的青霉素类药物对消费者的身体健康危害很大，因此，本研究的目的是制备能同时识别多种青霉素类药物的单克隆抗体，建立一种多残留免疫检测方法用于牛奶中该类药物的检测。
　　 本研究以6-氨基青霉烷酸为模板，合成了两个新的青霉素类药物通用半抗原，并采用戊二醛法和N，N-羰基二咪唑法与载体蛋白偶联合成两种免疫抗原和两种包被抗原。半抗原与载体蛋白的结合比范围在10-15∶1之间。用免疫抗原免疫Balb/C小鼠，选择血清效价最高且对半抗原有特异性的小鼠，将其脾细胞与骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞，采用小鼠体内诱生法制备抗青霉素类药物的广谱单克隆抗体。以该抗体为基础建立了一种间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)。以方阵滴定法确定包被抗原和抗体的最适工作浓度分别为10000和400000倍稀释。该方法可以同时检测11种青霉素类药物（阿莫西林，氨苄西林，青霉素G，青霉素V，磺苄西林，甲氧西林，氯唑西林，羧苄青霉素，双氯西林，苯唑西林，萘夫西林），对上述11种药物的IC50为5.0-36.2ng/mL，交叉反应率为16％-117％，最低检测限为0.7-9.3ng/mL。将这11种药物分别按不同浓度添加在空白牛奶中，添加回收率为77.6％-99.4％，变异系数低于13.5％。
　　 因此，本研究建立的ELISA方法可以作为牛奶中青霉素类药物残留的快速检测工具，以提供检测效率，保证动物性食品安全。

目录

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摘要

缩略词

第一章 引言

1 青霉素类药物概述

1．1 简介

1．2 药理作用、药动学及耐药性

1．3 应用及残留危害

2 国内外残留检测研究进展

3 人工抗原的制备方法

4 样品提取方法

5 研究目的和意义

第二章 青霉素类药物广谱单克隆抗体的制备

1 试验材料

1．1 试剂和药品

1．2 仪器与设备

1．3 试验动物和细胞

2 试验方法

2．1 通用半抗原的制备

2．2 通用完全抗原的制备

2．3 完全抗原的鉴定

2．4 动物免疫

2．5 杂交瘤细胞的制备

2．6 杂交瘤细胞的筛选与克隆

2．7 杂交瘤细胞的冻存与复苏

2．8 单克隆抗体的制备与纯化

2．9 单克隆抗体性质的鉴定

2．10 ELISA检测方法的建立

3 结果与分析

3．1 半抗原的鉴定

3．2 抗原鉴定

3．3 ELISA检测方法的建立

3．4 杂交瘤细胞株的建立

3．5 单克隆抗体的制备与鉴定

4 讨论

4．1 残留分析方法

4．2 半抗原与人工抗原

4．3 动物免疫

4．4 单克隆抗体

4．5 交叉反应性

4．6 ELISA方法

第三章 青霉素类药物多残留ELISA法的应用

1 试验材料

1．1 材料

1．2 仪器与试剂

1．3 溶液的制备

2 添加回收试验

2．1 样品提取

2．2 标准曲线的绘制

2．3 添加回收率的测定

2．4 回收率的计算

3 结果与分析

3．1 样品基质干扰

3．2 标准曲线

3．3 添加回收率

4 讨论

第四章 结论

参考文献

作者简介

致谢