高粱转录因子SbDREB2基因的克隆与功能分析

摘要

干旱、盐碱、低温等非生物逆境胁迫严重影响植物的生长发育，极端恶劣条件下甚至导致植株死亡，是农业生产中作物减产的重要因素。高等植物在长期进化过程中为了抵抗这些逆境形成了许多复杂的防御机制。其中DREB类转录因子是一类植物中所特有的，能与DRE顺式作用元件特异性结合的转录因子。该类转录因子在非生物逆境胁迫中能激活下游一系列抗逆功能基因的表达，并能提高脯氨酸和蔗糖含量。因此作物遗传育种中利用DREB转录因子来改良作物的抗逆性，能获得较为理想的综合效果。
　　 本研究以盐处理的高粱幼苗为试验材料，通过电子克隆和RT-PCR技术，克隆高粱DREB转录因子基因cDNA序列;利用实时荧光定量PCR技术对基因在不同逆境胁迫下表达模式进行了研究;对基因进行原核表达功能验证;并构建了植物表达载体转化烟草。研究结果如下:
　　 1、根据GenBank电子拼接所得序列设计引物OF和OR，进行RT-PCR扩增，得到cDNA序列1152bp，ORF长789bp，编码蛋白含262个氨基酸;利用上述引物扩增基因组DNA，得到1个1892bp片段，测序分析表明该基因包含一个740bp的内含子，将此基因命名为SbDREB2。预测蛋白分子量为28.64kD，等电点为5.52。氨基酸序列分析表明，该蛋白在82～145区含有DREB类转录因子家族特有的AP2保守结构域，与玉米DREB2A及水稻DREB1蛋白同源性分别为84％和69％。
　　 2、实时荧光定量PCR分析表明，该基因为组成型表达，在根、茎、叶中均存在表达，根中表达量约是茎中2.5倍，受干旱、高盐和外源ABA诱导强烈表达，但对低温几乎没有响应。
　　 3、设计含EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的特异性引物DF和DR，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切含有SbDREB2基因的T载体质粒和pET28a原核表达载体质粒，成功构建重组子pET28a-SbDREB2，经IPTG诱导获得32.5kD左右的融合蛋白，与预期理论值相符。
　　 4、设计含有BglⅡ和NcoⅠ酶切位点的特异性引物PF和PR，用BglⅡ和NcoⅠ双酶切含有SbDREB2基因的目的片段和pCAMBIA3301植物表达载体，T4 DNA Ligase过夜连接，成功构建重组载体pCAMBIA3301-SBDREB2。
　　 5、利用冻融法将重组表达载体pCAMBIA3301-SBDREB2转化到农杆菌EHA105中，经菌液PCR检测，证实表达载体已转入农杆菌。叶盘法转化烟草初步检测获得阳性植株。

目录

声明

摘要

本文所用缩略词

1 引言

1．1 植物抗逆性生理生化与分子机制研究

1．1．1 植物逆境条件下形态及生理上的变化

1．1．2 植物抗逆的分子机制

1．2 DREB转录因子的研究进展

1．2．1 DREB转录因子的结构特征与分类

1．2．2 DREB转录因子在逆境胁追中的作用

1．2．3 DREB转录因子与脱落酸信号转导途径的关联

1．2．4 DREB转录因子在植物抗逆基因工程中的研究进展

1．3 实时荧光定量PCR技术

1．3．1 实时荧光定量PCR技术的原理

1．3．2 实时荧光定量PCR技术的应用

1．4 本研究的内容和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料与胁迫处理

2．1．2 试验主要试剂

2．1．3 试验菌株和载体

2．2 试验方法

2．2．1 高梁叶片总RNA的提取

2．2．2 cDNA第一条链的合成

2．2．3 高梁SbDREB2基因编码区的获得

2．2．4 目的片段的回收

2．2．5 PCR扩增产物与T载体的连接、转化和测序

2．2．6 高梁基因组DNA的提取

2．2．7 SbDREB2基因的生物信息学分析

2．2．8 SbDREB2基因原核表达载体的构建

2．2．9 SDS-PAGE电泳检测SbDREB2在表达菌株BL21中的表达

2．2．10 SbDREB2基因的表达特性分析

2．2．11 SbDREB2基因植物表达载体的构建

2．2．12 p3301-SbDREB2转化烟草

3 结果与分析

3．1 高粱总RNA的提取

3．2 SbDREB2基因开放阅读框(ORF)的克隆

3．3 启动子序列分析

3．4 SbDREB2基因的生物信息学分析

3．5 蛋白多序列比对与系统进化树分析

3．6 SbDREB2蛋白的原核表达载体的构建及诱导表达

3．6．1 SbDREB2蛋白的原核表达载体的构建

3．6．2 SbDREB2蛋白诱导表达

3．7 SbDREB2基因在不同品种间表达特性分析

3．8 SbDREB2基因转化烟草

3．8．1 真核表达载体pCAMBIA3301-SbDREB2载体的构建

3．8．2 转烟草阳性植株的获得

4 讨论

4．1 高粱SbDREB2转录因子的序列分析

4．2 高粱SbDREB2基因启动子序列分析

4．3 SbDREB2蛋白原核表达分析

4．4 SbDREB2基因荧光定量PCR表达特性分析

4．5 SbDREB2基因下一步研究展望

5 结论

参考文献

附录Ⅰ：试验所用载体图谱

附录Ⅱ：试验中所用试剂配方

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢