强力霉素广谱单克隆抗体的制备及应用

摘要

四环素类药物是兽医临床常用的一类抗生素，常用的品种有四环素、金霉素、土霉素、强力霉素，主要用于家畜和家禽各种疾病的治疗。随着这些药物的广泛应用，它们在动物性食品中的残留逐渐受到重视。在四环素类抗生素的残留检测方法中，免疫分析法以其特异性高、简单、灵敏、快捷的特点而被广泛应用。
　　 本研究采用重氮法在强力霉素(DC)和金霉素(CTC)分子上分别引入对氨基苯乙酸，合成了两种新的半抗原DC-C和CTC-C。用混合酸酐法将半抗原DC-C和载体蛋白偶联，制备了免疫原DC-C-BSA和包被原DC-C-OA。用同样的方法将半抗原CTC-C与载体蛋白偶连，制备了包被原CTC-C-OA。经紫外测定，免疫原DC-C-BSA的偶联比为19∶1，包被原DC-C-OA的偶联比为15∶1，包被原CTC-C-OA的偶联比为9∶1。另外，将强力霉素与载体蛋白偶连，制备了免疫原DC-BSA和包被原DC-OA，偶联比分别为16∶1和11∶1。
　　 用两种免疫原分别免疫Balb/c小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，最终获得了两株分泌抗强力霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞。将获得的抗体和三种包被原两两组合成六种组合，通过优化筛选，确定了免疫原DC-C-BSA产生的抗体和包被原CTC-C-OA为最佳组合，建立了一种可以同时检测牛肉和牛奶中七种四环素类药物（强力霉素，四环素，金霉素，土霉素，米诺环素，美他环素，地美环素）残的间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)方法。在该方法中，包被抗原最适包被浓度为2.1μg/mL，单克隆抗体的最适工作浓度为1∶10000。该方法对七种四环素类药物的交叉反应率为47％～102％，检测限为1.5～6.9 ng/mL。七种药物在空白样品中的添加回收率为75.3％～106.8％，变异系数低于10.9％。
　　 因此，该ELISA方法快速、灵敏、方便，满足了四环素类残留检测的要求，适用于大批量样品的快速筛选检测。

目录

声明

摘要

缩略词

第一章 文献综述

1．1 四环素类药物概述

1．1．1 分类

1．1．2 结构与理化性质

1．1．3 药理作用

1．1．4 作用机理

1．1．5 药物动力学

1．1．6 药物相互作用

1．1．7 不良反应

1．1．8 耐药性

1．1．9 强力霉素在临床上的应用

1．2 残留分析

1．2．1 残留现状

1．2．2 残留管理

1．2．3 残留检测研究进展

1．2．4 三类检测方法的优缺点

1．3 未来展望

1．4 ELISA原理

1．5 人工抗原合成技术

1．5．1 半抗原的概述

1．5．2 半抗原的要求

1．5．3 半抗原的选择与设计

1．5．4 半抗原合成注意事项

1．5．5 载体的选择

1．5．6 合成方法

1．6 单克隆抗体制备原理

1．7 目的及意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 动物和细胞

2．1．3 主要仪器

2．1．4 ELISA溶液

2．1．5 细胞培养用液

2．1．6 其他用液

2．2 方法

2．2．1 半抗原的制备与鉴定

2．2．2 免疫原、包被原的合成与鉴定

2．2．3 抗血清的制备与鉴定

2．2．4．杂交瘤细胞的制备

2．2．5．杂交瘤细胞的筛选与克隆

2．2．6 细胞的冻存与复苏

2．2．7 单克隆抗体的制备与纯化

2．2．8 ELISA方法的建立

2．2．9 回收率的测定

2．2．10 方法评估

第三章 结果与讨论

3．1 半抗原的鉴定

3．1．1 半抗原DC-C的鉴定

3．1．2 半抗原CTC-C的鉴定

3．2 免疫原和包被原的鉴定

3．2．1 免疫原DC-C-BSA和包被原DC-C-OA、包被原CTC-C-OA的鉴定

3．2．2 免疫原DC-BSA和包被原DC-OA的鉴定

3．3 抗血清的制备与鉴定

3．3．1 包被抗原与抗血清工作浓度的确定

3．3．2 血清效价的测定

3．3．3 DC对抗血清的抑制反应

3．4 杂交瘤细胞株的建立

3．4．1 杂交瘤细胞株的建立

3．4．2 细胞形态

3．5 单克隆抗体的制备与鉴定

3．5．1 两株细胞上清效价及抑制的测定

3．5．2 腹水的制备

3．5．3 单克隆抗体的鉴定

3．6 ELISA方法的建立

3．7 样品的添加回收

3．8 方法评估

第四章 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢