中国境内部分区域葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的遗传分化

摘要

葡萄霜霉病（Grape Downy Mildew, GDM）由葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）引起，是世界范围内威胁葡萄生产的一种重要病害，常给葡萄产业带来重大经济损失。为研究葡萄霜霉菌对中国不同地区葡萄霜霉菌群体的遗传分化，本研究利用单斑分离法获取较纯菌株，通过多基因型分析方法对葡萄霜霉病菌进行遗传分化多态性分析，为葡萄霜霉病的防治提供分子水平的理论依据;同时也可以丰富葡萄霜霉菌遗传分化的数据库。
　　本研究以来自中国9个省、市的103份葡萄霜霉菌样品为材料，利用多基因型分析方法进行遗传分化和亲缘关系研究，主要研究结果如下:
　　1.由于菌株的易污染因而获得葡萄霜霉病菌的单孢纯培养困难，本研究开发了一种简便、快速、易操作且成功率高的葡萄霜霉病菌单孢子囊分离培养方法，成功构建了葡萄霜霉病菌菌株纯化与快速扩繁体系。
　　2.本研究对常规DNA提取方法—十六烷基三甲基溴化铵法进行了改良，用75％无水乙醇对收集的葡萄霜霉病菌样品进行杂质消除处理，保证葡萄霜霉病菌基因组DNA的质量和纯度，使其能满足多基因型技术的分析要求。
　　3.通过对P.viticola基因序列的多态性分析，计算种群的单倍型多样性Hd、核苷酸多样性指数π、核苷酸平均差异数k、及Tajima's D值中性检测的结果显示我国不同地区葡萄霜霉病菌种群间物种的进化存在多样性，核苷酸多样度较高，β-微管蛋白(TUB)基因和肌动蛋白基因的片段(ACT)中性检测P＜0.001差异极显著，表明基因的渗透和在群体遗传分化中的影响较大。
　　3.以葡萄霜霉病菌的标准菌株序列作为参考，以大豆疫霉Phytophthora-sojae为外围菌株进行多位点整合分析。运用遗传进化分析软件PAUP(V4.0)，通过TBR(treebisection-reconnection)交换算法的启发式搜索(heuristic search)得到，multitrees参数选用（默认），同时进行1000次Bootstrap自举法检验，并将Bootstrap产生的自举系数加入到树中，与美国葡萄霜霉种群遗传数据一起分析构建葡萄霜霉病菌分子进化树。表明，中国部分地区与美国地区聚为一支，bootstrap支持率为90％，遗传关系较近;且中国地区划分为四支，分别为山葡萄种群、刺葡萄、欧美杂种和欧亚种，bootstrap支持率分别为50％、70％、85％、80％，遗传关系较近，明确了中国地区葡萄霜霉病的遗传分化。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的危害与分布

1．1．1 葡萄霜霉病菌的发生与症状

1．1．2 葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)简述

1．2 分子生物学的研究和应用

1．2．1 常用分子生物学方法介绍

1．2．1 国内外研究现状

1．3 本研究的意义

2 材料和方法

2．1 供试材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 供试培养基及试剂配制

2．1．3 主要仪器设备

2．2 葡萄霜霉病菌的采集

2．2．1 供试的葡萄霜霉菌材料及来源

2．2．2 葡萄霜霉病菌培养体系的优化

2．2．3 葡萄霜霉病菌单孢分离

2．3 葡萄霜霉病菌的分子测定

2．3．1 病菌基因组DNA提取

2．3．2 DNA检测

2．3．3 筛选适合遗传分化研究的葡萄霜霉菌引物

2．3．4 葡萄霜霉菌PCR扩增

2．3．5 PCR产物纯化

2．3．6 PCR产物与pMD18-T载体的连接

2．3．7 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．3．8 连接产物转化感受态细胞

2．3．9 PCR验证阳性克隆

2．3．10 样品测序

2．4 数据统计分析

2．4．1 序列整理

2．4．2 葡萄霜霉菌基因核苷酸多态性分析

2．4．3 遗传发育树分析

3 结果与分析

3．1 建立单孢分离、扩繁体系

3．1．1 培养体系优化

3．1．2 单孢分离培养

3．2 葡萄霜霉病菌的分子评价

3．2．1 葡萄霜霉病菌基因组DNA检测

3．2．2 筛选适合遗传分化的研究引物

3．2．3 单克隆检测

3．3 遗传分化分析

3．3．1 P．viticola基因序列的同源性

3．3．2 P．viticola基因序列多态性分析

3．3．3 遗传发育树分析

4 讨论

4．1 建立葡萄霜霉病菌单孢分离体系要素

4．2 葡萄霜霉病种群的遗传分化

4．2．1 多基因型技术在遗传分化研究中的可靠性和可行性

4．2．2 系统发育树与遗传分化的关系

4．2．3 寄主扩张和农业化栽培与遗传分化的关系

5 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢