组培条件下苹果潜隐性病毒的分布特征及传播途径研究

摘要

目前，我国苹果的栽培面积和总产量均居世界前列，但单产低，品质差，病毒病是造成这一现象的重要原因之一。许多研究者提出，实行无毒化栽培可从根本上防治苹果病毒病。目前苹果无毒苗大多来自于离体保存的无病毒原种。但实际生产中发现，无病毒原种经长时间的保存和扩繁，会出现病毒再次检出现象，这就给苹果无毒化生产带来一定的安全隐患。为此，准确掌握组培条件下苹果潜隐性病毒的体内分布、含量变化因素及传播途径，有利于明确无病毒原种的适宜保存条件和更好地预防病毒传播，进而推进无毒化栽培的进程。本研究以带毒苹果组培苗为试材，运用FQ-PCR和常规RT-PCR技术，研究分析了组培苗中苹果潜隐性病毒的分布和含量变化规律及病毒传播途径。主要结果如下:
　　1.组培条件下ASGV和ACLSV的分布与含量变化的研究
　　试验以同时携带ASGV和ACLSV的苹果砧木组培苗P22为试材，运用FQ-PCR技术，研究了组培苗不同部位以及不同培养天数和培养温度下上述两种病毒的含量变化。结果表明:
　　(1)在组培条件下，两种病毒在不同部位的相对含量存在显著差异，且病毒种类不同，分布规律亦不同。其中，ASGV在顶端1cm、中部、基部1cm的相对含量由高至低为顶端＞中部＞基部，表现为中上部积累特性;而ACLSV相对含量表现为基部＞中部＞顶部的中下部积累特性。
　　(2)不同培养温度下组培苗内ASGV和ACLSV的含量存在差异。ASGV和ACLSV含量由高至低均表现为:5℃＞25℃＞32/38℃＞35℃。在低温培养下苹果病毒含量较高，高温抑制病毒复制。
　　2.变温处理对苹果潜隐性病毒的脱除效果研究
　　试验以同时携带ASGV、ASPV、ACLSV的八棱海棠、小金海棠、华红和JAZZ4个砧木和品种组培苗为试材，采用32/38℃的变温处理，运用RT-PCR技术对组培苗进行跟踪检测，结果表明:
　　变温处理后检测无毒的苗子仍有病毒复现的可能。其中ASGV最先检出，其次为ACLSV，ASPV检出时间最晚。对变温处理脱毒后的苗子进行跟踪检测、定期抽检或更新十分必要。
　　3.组培条件下ASGV和ACLSV的传播途径研究
　　试验以同时携带ASGV和ACLSV的苹果砧木组培苗P22和珠美海棠无毒组培苗为试材，人为模拟了5种方式进行传毒，研究了组培条件下病毒可能的传播途径及传毒速度。结果表明:
　　(1)组培条件下，ASGV和ACLSV可经微嫁接、根系接触、工具交叉使用、培养基介质以及汁液传毒，且传毒几率由高至低为:微嫁接＞根系接触＞工具交叉使用＞培养基介质＞汁液传毒。
　　(2)组培条件下，无论于植物生态学的上端还是下端接种苹果病毒，接种5天时，在近接种端均可检出病毒，10天时病毒检出率就可达到90.00％左右。且接种下端时病毒的传输速率快于接种上端。ASGV较ACLSV传毒更快，侵染率更高。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 苹果病毒病国内外研究进展

1．2 苹果病毒的特性及危害特点

1．2．1 苹果茎沟病毒

1．2．2 苹果褪绿叶斑病毒

1．2．3 苹果茎痘病毒

1．2．4 苹果锈果类病毒

1．2．5 苹果花叶病毒

1．3 我国苹果病毒的分布

1．4 苹果病毒的传播途径

1．5 外界环境对植物病毒体内分布的影响

1．6 苹果病毒脱毒技术

1．7 病毒检测技术

1．7．1 指示植物检测法

1．7．2 电子显微技术

1．7．3 酶联免疫吸附法

1．7．4 分子生物学方法

1．8 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试剂和仪器

2．2．1 主要试剂

2．2．2 主要仪器

2．3 总RNA的提取和质量检测

2．3．1 总RNA的提取

2．3．2 总RNA质量检测

2．4 苹果潜隐性病毒RT-PCR检测体系

2．4．1 引物序列合成

2．4．2 反转录体系

2．4．3 PCR检测体系

2．4．4 PCR产物凝胶分析

2．5 ASGV和ACLSV荧光定量PCR体系

2．6 组培条件下ASGV和ACLSV的分布与含量变化研究

2．7 变温处理对苹果潜隐性病毒的脱除效果研究

2．7．1 变温处理过程

2．7．2 结果统计

2．8 组培条件下ASGV和ACLSV的传播途径研究

2．8．1 苹果潜隐性病毒的传播途径研究

2．8．2 苹果潜隐性病毒的传播速度研究

2．8．3 检测结果统计

3 结果与分析

3．1 总RNA提取及苹果病毒RT-PCR检测效果图

3．1．1 样品的总RNA提取效果图

3．1．2 苹果潜隐性病毒两步多重PCR检测效果图

3．2 荧光定量检测体系可靠性验证

3．3 组培条件下ASGV和ACLSV的分布与含量变化研究

3．3．1 同一株带毒组培苗，不同部位ASGV和ACLSV相对含量的差异

3．3．2 一个继代周期不同继代天数，ASGV和ACLSV相对含量的变化趋势

3．3．3 不同培养温度对ASGV和ACLSV相对含量的影响

3．4 变温处理对苹果潜隐性病毒的脱除效果研究

3．4．1 变温处理对植株生长的影响

3．4．2 不同变温处理条件对病毒脱除的影响

3．4．3 不同苹果基因型的脱毒效果比较

3．4．4 不同病毒类型脱除效果比较

3．4．5 不同时间病毒检出率比较

3．5 组培条件下ASGV和ACLSV的传播途径研究

3．5．1 组培条件下，不同传毒途径苹果潜隐性病毒传毒情况检测

3．5．2 组培苗中ASGV和ACLSV传毒差异比较

3．5．3 苹果潜隐性病毒传播速度及积累规律研究

3．5．4 组培苗中ASGV和ACLSV传播速度和积累规律差异比较

4 讨论

4．1 ASGV和ACLSV在组培苗不同部位及不同培养天数下的相对含量变化

4．2 组织培养温度对苹果潜隐性病毒含量变化的影响

4．3 组培条件下苹果潜隐性病毒的传播途径研究

4．4 苹果潜隐性病毒的变温热处理脱毒效果分析

5 结论

参考文献

在读期间发表论文

作者简历

致谢