八棱海棠种子中苹果潜隐性病毒的分布特征及脱除技术研究

摘要

病毒病严重影响苹果的树体生长及果实品质，目前尚无有效的防治药剂，一旦侵染就很难根除，因此培育无病毒苗木实行无毒化栽培成为防治苹果病毒病的有效途径。目前，我国生产上普遍应用的苹果苗木多为乔砧和矮化中间砧苗木，两种苗木均以实生苗为砧木（基砧）。八棱海棠（Malus robusta Rehd.）实生苗根系发达、适应性强、耐盐碱，是我国北方苹果主产区应用最为广泛的苹果砧木之一。长期以来，人们普遍认为实生苗不携带病毒，但在实际生产中发现有些实生苗表现出病毒病的症状。为了明确八棱海棠种子是否携带苹果潜隐性病毒，本研究以河北怀来八棱海棠种子为试材，运用多重RT-PCR技术，研究分析了八棱海棠种子的带毒情况、不同药剂对种子病毒的脱除效果以及八棱海棠种子病毒的分布特征。主要结果如下:
　　 1.以八棱海棠果实及种子为试材，研究了其适宜的总RNA提取方法。结果表明，宝生物公司生产的RNAiso Plus和RNAiso-mate for Plant Tissue两种试剂结合使用适宜枝皮组织、种子及种胚高质量RNA的提取，但不适用于果皮和果肉;适宜果皮和果肉总RNA提取的试剂为天根生化科技有限公司生产的RNAplant植物总RNA提取试剂。
　　 2.运用多重RT-PCR技术对随机采取的八棱海棠种子进行苹果潜隐性病毒检测，结果表明，种子携带苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒，总体带毒率为33％，复合侵染率为4％，苹果茎沟病毒带毒率为28％，苹果褪绿叶斑病毒带毒率为9％，但未检测出苹果茎痘病毒。
　　 3.以确定带毒母树的果实为试材，对果实的不同部位进行了潜隐性病毒检测。结果表明:不同发育期果实果皮、果肉和种子的带毒情况存在一定差异。果实膨大期的果皮果肉均携带苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒，但只有53.33％的果皮和13.33％的果肉携带苹果茎痘病毒;成熟果实果皮果肉同时携带苹果茎沟病毒、苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎痘病毒三种潜隐性病毒;膨大期果实的种子均携带苹果茎沟病毒和苹果褪绿叶斑病毒，苹果茎痘病毒病毒带毒率为88.23％;成熟果实种子苹果茎沟病毒带毒率69.23％，苹果褪绿叶斑病毒带毒率为53.25％，苹果茎痘病毒带毒率为42.86％。对带毒母树种子的种胚进行病毒检测，种胚的苹果茎沟病毒带毒率为25％，苹果褪绿叶斑病毒带毒率为8.34％，种胚未检测到苹果茎痘病毒。
　　 4.以带毒母树上采集的种子为试材，运用RT-PCR技术对清洗浸泡的种子进行苹果潜隐性病毒检测。结果表明，清洗后苹果茎沟病毒带毒率下降到64％，苹果褪绿叶斑病毒带毒率下降到26％，而未检测到苹果茎痘病毒。
　　 5.理化处理能够脱除种子携带的病毒，本研究以随机采取的八棱海棠种子为试材，采用80℃的热水、10％的磷酸三钠溶液、1％高锰酸钾溶液和2％的氢氧化钠溶液分别浸种30min，运用RT-PCR技术检测不同处理种子的带毒率，并对处理后的种子进行萌发试验。结果表明，各个处理均能不同程度地降低八棱海棠种子的带毒率。其中热水处理对脱除苹果茎沟病毒无效，高锰酸钾和磷酸三钠效果较好，脱毒效率为42％，而氢氧化钠效果最好，脱毒效率为82％。理化处理均不同程度的影响了种子的萌发力，其中热水处理的发芽率和发芽势下降幅度最大。
　　 6.为筛选脱毒率高且对种子萌发力负效应较小的处理组合，对氢氧化钠浸种处理进行了优化，分别设置了1％和2％的2个浓度组合和10min、20 min、30 min、40 min和60 min5个时间组合对氢氧化钠的浸种处理进行了优化，结果表明，1％氢氧化钠浸种脱除种子潜隐性病毒的效果不明显;2％氢氧化钠不同时间处理之间脱除效果存在一定的差异，氢氧化钠溶液浸种20min、30min和40min时，脱除效率较高且相近，综合考虑处理的脱毒效果及其对萌发力的影响，2％氢氧化钠浸种20min-30min为最佳的理化处理组合。
　　 为筛选出更适宜的处理组合，以怀来八棱海棠采种圃带毒母树种子为试材，用1.5％氢氧化钠分别浸种20min、30min和40min，对氢氧化钠处理组合做了进一步的优化。结果表明，1.5％氢氧化钠浸种处理40min和2％氢氧化钠浸种处理30min，脱除苹果潜隐性病毒的效率大体相同，但1.5％氢氧化钠浸种处理对种子的萌发力无影响。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 引言

1．1 苹果病毒研究的国内外现状

1．2 苹果病毒病概述

1．3 病毒的检测技术

1．3．1 指示植物法

1．3．2 电子显微技术

1．3．3 酶联免疫吸附测定法

1．3．4 分子生物学技术

1．4 病毒的传播途径及防治措施

1．5 我国无毒化苗木的生产现状

1．5．1 病毒的脱除方法

1．5．2 无病毒苗木的繁育

1．6 本研究的目的意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试剂和仪器

2．3 总RNA的提取及完整性检测

2．3．1 八棱海棠不同组织的总RNA提取方法

2．3．2 总RNA完整性检测

2．4 三种苹果潜隐性病毒的两步多重RT-PCR检测体系

2．4．1 反转录体系

2．4．2 苹果潜隐性病毒的RT-PCR检测体系

2．4．3 PCR产物的凝胶分析

2．5 随机采取的八棱海棠种子的带毒情况

2．6 八棱海棠种子潜隐性病毒的分布特征

2．7 八棱海棠种子潜隐性病毒的脱除

2．7．1 药剂种类的筛选

2．7．2 氢氧化钠处理浓度与时间的筛选

2．8 不同理化处理对八棱海棠种子萌芽的影响

3 结果与分析

3．1 不同方法提取总RNA的结果比较

3．1．1 RNAiso-mate for Plant Tissue和RNAiso Plus两种试剂结合

3．1．2 RNAplant植物总RNA提取试剂

3．2 随机采取的八棱海棠种子的带毒状况

3．3 八棱海棠种子中苹果潜隐性病毒的分布特征

3．3．1 带毒母树鉴定

3．3．2 八棱海棠果实不同发育时期果皮果肉的带毒情况

3．3．3 带毒母树种子的带毒情况

3．3．4 成熟种胚的带毒情况

3．3．5 实生后代的带毒情况

3．4 八棱海棠种子潜隐性病毒的脱除技术

3．4．1 不同理化处理对种子潜隐性病毒的脱除效果及对种子萌发力的影响

3．4．2 氢氧化钠处理浓度与时间优化

3．4．3 氢氧化钠浓度的进一步优化

4 讨论

4．1 八棱海棠不同组织RNA的提取方法

4．2 苹果潜隐性病毒的分布特征

4．2．1 八棱海棠种子带毒情况

4．2．2 八棱海棠种子中苹果潜隐性病毒的分布特征

4．3 理化处理的脱除效率及其对种子萌发力的影响

4．3．1 理化处理对种子萌发力的影响

4．3．2 脱除苹果潜隐性病毒的药剂筛选

4．3．3 氢氧化钠处理浓度与时间筛选

5 结论

参考文献

在校期间发表论文

作者简历

致谢