绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

摘要

早孕因子（Early pregnancy factor，EPF）是母体受精后从血清中检测出最早与妊娠相关的蛋白，是与妊娠相关的免疫抑制因子，被认为是最早能确认妊娠的生化指标之一。在养殖生产中，利用早孕因子的特异性可以及时进行绵羊的妊娠诊断,减少其空怀发生，为提高生产效率提供重要意义。同时，EPF还可以跟踪妊娠母体中胎儿的发育情况，鉴定胚胎移植效果。
　　目的:应用分子生物和细胞融合技术制备了绵羊早孕因子重组蛋白和单克隆抗体，为进一步研制早孕因子试剂盒奠定基础。
　　方法:对表达菌pGEX4t-EPF-BL21(DE)进行IPTG诱导剂，对诱导剂IPTG进行条件优化。将表达出的绵羊早孕因子重组蛋白(EPF-GST)，通过亲和吸附层析柱对蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE进行鉴定。以纯化后的EPF重组蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠，免疫3次，每次免疫时间间隔为15天，后采用间接ELISA方法检测小鼠效价，取效价合格小鼠(N/P≧2)的脾细胞，将脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，对杂交瘤细胞进行ELISA方法进行筛选，筛选出阳性杂交瘤细胞和细胞株。经有限稀释法将筛选的细胞株注入小鼠腹腔，用G-sepharose柱亲合层析法对小鼠腹水型抗体进行纯化，应用SDS-PAGE和Western blot分析抗体纯化后的纯度及特异性。
　　结果:在37℃下，表达菌最佳优化条件为:IPTG浓度0.5mmol/mL，诱导时间4h，在此诱导条件下表达菌能最大量表达绵羊EPF重组蛋白，重组蛋白分子量大小为26KD（其中早孕因子蛋白为10KD，标签蛋白为16KD），且该表达重组蛋白以可溶性形式存在。用纯化后的重组蛋白免疫小鼠，小鼠血清效价可达1∶16000。取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到了1株抗绵羊EPF单克隆抗体的细胞株B4D5，效价为1∶1000。腹水型抗体经G-sepharose柱亲合层析，SDS-PAGE和Western blot检测，得到纯度较高的单克隆抗体，且与绵羊EPF具有一定的特异性。
　　结论:从表达菌中制备出了绵羊EPF重组蛋白(EPF-GST)，以重组蛋白免疫小鼠，得到了绵羊早孕因子单克隆抗体。

目录

声明

论文说明

摘要

1 引言

1．1 早孕因子的介绍

1．1．1 早孕因子的来源

1．1．2 早孕因子的生物学特性

1．1．3 早孕因子的生物学作用

1．1．4 早孕因子的分离纯化

1．1．5 早孕因子的临床应用

1．1．6 检测早孕因子方法的介绍

1．2 单克隆抗体技术介绍

1．2．1 单克隆抗体概念

1．2．2 制备单克隆抗体的基本原理

1．2．3 单克隆抗体和多克隆抗体性质的比较

1．3 本课题的目的和意义

2 绵羊早孕因子蛋白的纯化

2．1 试验材料

2．1．1 主要仪器与设备

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要溶液配制

2．2 试验方法

2．2．1 工程菌的活化

2．2．2 IPTG诱导剂表达时间的优化

2．2．3 IPTG诱导剂浓度的优化

2．2．4 蛋白纯化

2．3 结果与分析

2．3．1 诱导时间的优化

2．3．2 诱导浓度的优化

2．3．3 重组蛋白的纯化

2．4 讨论

3 绵羊早孕因子单克隆抗体的制备及鉴定

3．1 试验材料

3．1．1 主要仪器和设备

3．1．2 实验动物与主要试剂

3．1．3 主要溶液配制

3．2 试验方法

3．2．1 免疫动物

3．2．2 抗原乳化剂制备

3．2．3 免疫方法

3．2．4 检测小鼠血清效价(间接ELISA方法)

3．2．5 建立杂交瘤细胞株

3．2．6 筛选杂交瘤细胞

3．2．7 杂交瘤细胞亚克隆与冻存

3．2．8 杂交瘤细胞的冻存

3．2．9 单克隆抗体的制备

3．2．10 单克隆抗体的纯化

3．2．11 杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定

3．3 结果与分析

3．3．1 小鼠三免后效价检测结果

3．3．2 杂交瘤细胞系的建立

3．3．3 腹水型单克隆抗体的效价

3．3．4 杂交瘤细胞染色体及单克隆抗体亚类鉴定

3．3．5 单克隆抗体的纯化

3．3．6 单克隆抗体特异性检测

3．4 讨论

3．4．1 关于动物选择

3．4．2 关于动物免疫

3．4．3 关于细胞融合

3．4．4 关于杂交瘤细胞的筛选和克隆

3．4．5 ELISA方法包被原的选择

3．4．6 关于单克隆抗体特异性

展望

结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢