肿瘤源性早孕因子单克隆抗体制备及鉴定

摘要

目的：应用基因工程技术制备肿瘤源性重组EPF，将其与弗氏佐剂混合后对BALB/c 小鼠进行免疫，并以较为成熟的单克隆抗体杂交瘤技术，建立分泌抗EPF单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备EPF 单克隆抗体，为进一步探索以EPF 单克隆抗体为基础的酶联免疫吸附测定（ELISA）等方法进行超早孕及某些恶性肿瘤等的早期诊断奠定基础。 方法：从黑色素瘤标本中提取总RNA，RT-PCR 扩增EPF 基因，将扩增产物和载体pGEX-5X-1进行双酶切后回收，连接载体和目的片段，获得重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌BL21。在大肠杆菌BL21中通过IPTG 进行诱导表达，然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠亲和层析纯化，经Xa 酶切得到纯的EPF 蛋白。用SDS-PAGE 鉴定其纯度，用玫瑰花环抑制试验（RIT）检测其生物学活性。将制备的重组肿瘤源性EPF 蛋白作为抗原免疫BALB/c 小鼠，用免疫后的小鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞（NS-1）融合，并通过间接ELISA方法筛选克隆阳性杂交瘤细胞株，经克隆化，获得可稳定分泌抗EPF 单克隆抗体的细胞株。注入BALB/c 小鼠腹腔制备腹水型单克隆抗体，经Protein-G 亲和层析纯化，SDS-PAGE和Western-blot 等方法鉴定EPF 单克隆抗体。 结果：制备的重组EPF 纯度较好，具有良好的免疫原性。融合后经克隆化获得五株稳定分泌抗EPF 抗体的细胞株，将细胞注射入BALB/c 小鼠腹腔获得腹水型单克隆抗体，以亲和层析法纯化，SDS-PAGE 分析显示纯化后去掉大部分杂蛋白，抗体纯度较高，Western-blot 分析显示抗体与抗原匹配性良好。 结论：制备的重组EPF蛋白纯度高且具有良好的免疫原性。获得五株稳定分泌抗EPF 抗体的杂交瘤细胞株。制备的EPF 单克隆抗体纯度好，与抗原匹配性良好。

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英文文摘

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前 言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

本文创新之处、问题与展望

参考文献

综 述早孕因子的研究进展

攻读硕士学位期间取得的研究成果

致 谢