玉米大斑病菌黑色素合成调控基因StMR1转录活性及调控机制分析

摘要

玉米大斑病(Northern Leaf Blight of Corn)是玉米生产中重要的叶部病害，常造成严重经济损失，直接影响玉米安全生产。引起玉米大斑病的病原真菌为大斑刚毛座腔菌Setosphaeria turcica(Luttrell)Leonard&Suggs，黑色素是其重要的致病因子之一，本实验室前期分离鉴定了一个对黑色素生物合成途径具有调控作用的转录因子St MR1，本研究通过酵母自激活试验对其转录激活活性及对酵母细胞毒性进行分析;通过构建GFP标记的过表达载体进行亚细胞定位;利用染色质免疫共沉淀方法，分析其调控黑色素合成酶基因的分子机制。主要结果如下:
　　1.构建了StMR1基因诱饵表达载体，转录激活活性分析表明其具有较高的转录激活活性，且对酵母细胞无毒性;
　　2.以GFP标记的pBARKS1质粒为载体构建了St MR1基因过表达载体，并通过PEG介导的方法转化玉米大斑病菌菌株01-23，得到过表达菌株;
　　3.荧光观察，StMR1基因定位于细胞核中，符合StMR1基因为转录因子通过作用于靶基因启动子区而调控靶基因表达的特性;
　　4.对病菌染色质免疫共沉淀的试验条件进行了探索，发现当甲醛浓度为1％时交联30 min使用180W5 s超声/10 s间歇、工作2～3 min可使染色质片段断裂至200～1000 bp，适合进行下游试验;
　　5.利用NNPP等启动子分析网站对黑色素合成酶基因上游约2000 bp碱基序列进行启动予及顺式作用元件位点分析，获得了各基因预测启动子位点及蛋白结合位点;
　　6.利用染色质免疫共沉淀技术分析StMR1基因对黑色素合成过程中6个合成酶基因的调控作用，明确了StMR1基因通过直接调控黑色素合成酶基因St3HNR、St4HNR、StLAC2、StPKS的表达调节玉米大斑病菌黑色素的生物合成。

目录

声明

摘要

缩写词表

1 引言

1．1 玉米大斑病的生产危害

1．2 玉米大斑病菌的黑色素及其生物合成

1．3 染色质免疫共沉淀技术研究

1．4 本试验研究目的与意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 菌株、质粒载体

2．1．2 培养基及其配制

2．1．3 药品及试剂配制

2．1．4 主要仪器

2．1．5 试验所需引物

2．2 StMR1基因诱饵表达载体构建及其转录活性分析

2．2．1 StMR1基因诱饵表达载体的构建

2．2．2 StMR1基因诱饵表达载体的酵母转化

2．2．3 StMR1基因的转录活·性分析

2．3 StMR1基因过表达载体构建

2．4 StMR1基因过表达菌株获得及验证

2．4．1 原生质体转化方法步骤

2．4．2 转化子PCR验证

2．5 Stmr1p亚细胞定位

2．6 黑色素合成酶基因顺式作用元件预测及转录因子结合位点引物设计

2．7 染色质免疫共沉淀分析StMR1基因对黑色素合成酶基因调控

2．7．1 染色质免疫共沉淀(CHIP)试验

2．7．2 StMR1基因对黑色素合成酶基因调控作用分析

3 结果与分析

3．1 玉米大斑病菌StMR1基因诱饵表达载体构建与验证

3．1．1 StMR1基因cDNA克隆

3．1．2 StMR1基因与pGBKT7载体的连接

3．1．3 诱饵表达载体StMR1-BD酶切验证

3．2 诱饵表达载体的酵母转化及其转录活性分析

3．3 玉米大斑病菌StMR1基因过表达载体构建

3．3．1 StMR1基因扩增

3．3．2 终载体的获得与验证

3．4 玉米大斑病菌StMR1过表达菌株获得及验证

3．4．1 原生质体转化

3．4．2 过表达菌株PCR验证结果及表型观察

3．5 玉米大斑病菌StMR1基因亚细胞定位

3．6 玉米大斑病菌StMR1基因调控黑色素合成酶位点分析

3．6．1 黑色素合成关键基因的表达

3．6．2 黑色素合成酶基因转录调控元件分析

3．6．3 超声破碎条件

3．6．4 Stmr1p蛋白DNA靶点分析

4 讨论

4．1 研究植物病原真菌黑色素调控基因表达蛋白的意义

4．2 玉米大斑病菌StMR1基因与黑色素生物合成关系

4．3 染色质免疫共沉淀与StMR1靶基因研究

5 结论

参考文献

在校期间发表论文

作者简历

致谢