5-羟基-雌马酚产生菌的分离、耐氧驯化及耐氧机制研究

摘要

大豆异黄酮(Soy isoflavones)是大豆等豆科植物在其生长过程中生成的一类次生代谢产物，其中染料木素和黄豆苷原为大豆异黄酮的主要成分。大豆异黄酮化学结构与雌激素相似，能够与雌激素受体结合，因此被称为植物雌激素。大豆异黄酮具有抗癌、抗骨质疏松，治疗心血管疾病等多种生理功能。然而，目前大量研究证实，被摄入机体的大豆异黄酮可被寄居在胃肠道的微生物菌群降解为二氢黄豆苷原、四氢黄豆苷原、二氢染料木素、去氧甲基安哥拉紫檀素、雌马酚和4-乙基苯酚等不同代谢产物。
　　本研究从公鸡新鲜粪样中分离得到一株能在厌氧条件下对染料木素有转化作用的短杆状严格厌氧细菌菌株AUH-JLC257。经16S rDNA序列分析，菌株AUH-JLC257与斯奈克氏菌Slackia equolifaciens DZE相似性为99.27％。利用紫外吸收光谱、ESI质谱以及核磁共振氢谱和碳谱等，将菌株AUH-JLC257代谢底物染料木素后生成的产物鉴定为5-羟基-雌马酚。通过手性高效液相色谱检测发现5-羟基-雌马酚只有一个物质峰，表明其对映体过量率为100％;通过旋光性测定发现，生成的5-羟基-雌马酚为左旋-5-羟基-雌马酚。通过对菌株转化能力测定，发现菌株AUH-JLC257能高效转化底物染料木素的最大浓度为0.6 mmol/L，平均转化率为83.05％。菌株AUH-JLC257除对染料木素具有转化能力外，还能将底物黄豆苷原转化为雌马酚。
　　为提高菌株AUH-JLC257的耐氧能力，对其进行长期耐氧驯化尝试，最终获得一株在有氧条件下生长的耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257。通过对比研究发现，与原出发菌株AUH-JLC257相比，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257在很多方面发生了改变。在菌体形态上，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257由原来的小短杆变为长丝;在生理生化特性上，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257增加了对葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、柳醇、纤维二糖、甘露糖、棉籽糖、海藻糖和七叶灵的利用能力。
　　通过高效液相检测发现，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257在有氧条件下不能将底物染料木素和黄豆苷原转化为5-羟基-雌马酚和雌马酚，但可以将底物染料木素和黄豆苷原分别还原为二氧染料木素(DHG)和二氢黄豆苷原(DHD)。其中DHG和DHD分别为5-羟基-雌马酚和雌马酚生物合成的前体。此外，通过转化动态研究发现，在有空气氧的条件下，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257转化底物染料木素或黄豆苷原时，产物DHG和DHD均发生了回转现象，添加还原剂回转现象消失。另外，通过向培养基中添加还原剂可显著提高耐氧突变株的有氧转化能力。当向培养基中添加0.1％的抗坏血酸时，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257可转化染料木素和黄豆苷原的最大浓度分别为1.6 mmol/L和0.6 mmol/L，平均转化率分别为79.37％和82.67％。
　　通过耐氧机制研究发现，耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257耐受氧气的机制包括:通过产生NO气体和形成NADH氧化酶-NADH过氧化物酶体系主动耗氧，通过产生H2外排氧气以及通过形成抗氧化“保护膜”结构防氧等。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 大豆异黄酮主要成分及生理活性

1．1．1 大豆异黄酮结构及组成

1．1．2 大豆异黄酮的生理功能

1．2 大豆异黄酮转化菌的研究

1．2．1 大豆异黄酮的吸收代谢

1．2．2 5-羟基-雌马酚产生菌的分离筛选

1．2．3 大豆异黄酮代谢产物的生物学活性

1．3 微生物耐氧驯化

1．4 研究意义及创新点

1．4．1 研究意义

1．4．2 创新点

第二章 5-羟基-雌马酚产生菌的分离筛选与鉴定

2．1 试验材料

2．1．1 供试菌群来源

2．1．2 菌株分离培养基

2．1．3 药品与试剂

2．1．4 主要试验仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 菌株分离

2．2．2 菌株转化活性的检测

2．2．3 染料木素转化产物的分离纯化与鉴定

2．2．4 染料木素转化产物的手征性测定

2．2．5 菌株对底物染料木素最大转化能力测定

2．2．6 转化菌株耐氧性能的测定

2．2．7 转化菌株的纯化与菌种保藏

2．2．8 转化菌株的菌种鉴定

2．3 实验结果

2．3．1 染料木素转化菌株的分离与鉴定

2．3．2 染料木素转化产物的分离纯化

2．3．3 染料木素转化产物的结构鉴定

2．3．4 产物5-羟基-雌马酚的手征性测定

2．3．5 菌株AUH-JLC257对底物染料木素最大转化能力测定

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 5-羟基-雌马酚产生菌的耐氧驯化及生物学特性

3．1 试验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 耐氧驯化培养基

3．1．3 药品与试剂

3．1．4 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 耐氧驯化

3．2．2 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257菌体形态观察

3．2．3 生理生化特性

3．2．4 菌株生长特性

3．2．5 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257的耐氧特性

3．3 结果与分析

3．3．1 菌株AUH-JLC257耐氧驯化前后菌体形态特性比较

3．3．2 菌株AUH-JLC257耐氧驯化前后生长特性比较

3．3．3 耐氧驯化前后菌体生理生化特征比较

3．3．4 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257耐氧能力分析

3．4 结论

第四章 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257有氧转化与调控研究

4．1 试验材料

4．1．1 药品与试剂

4．1．2 主要仪器与设备

4．2 试验方法

4．2．1 耐氧突变株转化产物分离纯化与结构鉴定

4．2．2 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257有氧转化动态

4．2．3 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257有氧转化能力的测定

4．2．4 通过添加还原剂对耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257有氧转化进行调控

4．2．5 添加还原剂后耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257对底物最大转化能力测定

4．3 结果与分析

4．3．1 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257对不同底物的有氧转化

4．3．2 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257对不同底物的有氧转化动态

4．3．3 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257在有氧下对底物最大转化能力测定

4．3．4 添加还原剂对耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257有氧转化调控

4．3．5 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257对底物最大转化能力测定

4．4 结论

第五章 耐氧突变株Aeroto-AUH-JLC2H-257的耐氧机制

5．1 实验材料

5．1．1 药品与试剂

5．1．2 主要仪器设备

5．2 实验方法

5．2．1 耐氧突变株抗氧化“保护膜”结构观察

5．2．2 NO含量的检测

5．2．3 NADH氧化酶及NADH过氧化氢酶活性的检测

5．3 结果与分析

5．3．1 耐氧突变株抗氧化“保护膜”的主动“防氧”机制

5．3．2 耐氧突变株的主动“耗氧”机制

5．3．3 耐氧突变株的主动“驱氧”机制

5．3．4 耐氧突变株的主动“避氧”机制

5．4 讨论

结论

参考文献

作者简历

致谢