产脂肪酶菌株Serratia marcescens Lipa1318的分离鉴定、发酵条件优化及其脂肪酶基因的克隆表达

摘要

脂肪酶在食品、药品、洗涤剂、化妆品和生物柴油合成等领域拥有广泛的用途，并且备受人们关注。发掘具有脂肪酶高产潜力的微生物资源及其基因资源并加以开发利用对脂肪酶的酶学研究和实际应用具有重要的意义。
　　本文主要进行了以下方面的研究:
　　(1)产脂肪酶菌株Serratia marcescens Lipa1318筛选和鉴定:采用吐温平板与橄榄油油脂板结合的方法从采集自河北省各地油污丰富的122份土样中初步筛选到57株脂肪酶产生菌。用p-NPP法复筛获得一株高产脂肪酶的菌株Lipa1318，酶活达到2.56U/mL。通过对该菌株的形态、培养特征及主要生理生化特征的鉴定确认其是粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens);PCR扩增得到该菌株1535 bp长的16S rDNA保守序列，与NCBI公布的16S rDNA序列进行比对分析，并通过MEGA4.1软件构建系统进化树最终确定该菌株为S.marcescens，故将该菌株命名为S.marcescens Lipa1318。对菌株Lipa1318粗酶液的最适温度、最适pH值及温度和pH值稳定性的研究结果表明该菌株脂肪酶的最适反应温度为60℃，最适pH为8.0，此条件下酶活为3.56 U/mL。该酶在50℃下保温1h后酶活保持约90％;在pH值5.0～11.0之间，30℃保温2.5 h后，酶活仍保持70％，说明该酶是一种耐热碱性脂肪酶，且具有良好的热稳定性及pH稳定性。
　　(2)S.marcescens Lipa1318产脂肪酶发酵条件优化:通过单因子试验及响应面设计软件Design-Expert V8.0.6.1对菌株S.marcescens Lipa1318进行产酶条件的优化。结果显示该菌株的最适产酶条件为:在含1.0％的牛肉膏、0.31％的葡萄糖、0.15％酵母粉、0.54％ TritonⅩ-100、0.50 mmol/L Ca2+、初始pH8.0的发酵培养基中，按4％接种量接种于装液量为60 mL的300 mL三角瓶中，30℃发酵培养96 h，最高酶活可达（13.95±0.07）U/mL。按照上述培养条件对菌株Lipa1318进行10L发酵试验，发酵液酶活力提高到25.32 U/mL，较摇瓶发酵的酶活提高了近2倍。
　　(3)S.marcescens Lipa1318脂肪酶基因的克隆和表达:根据GenBank中已知的S.marcescens脂肪酶基因序列设计相应引物，成功克隆了S.marcescens Lipa1318的脂肪酶基因并命名为lipA，GenBank登录号为KJ669102。lipA长1845 bp，同源序列比对结果表明lipA基因与其他S.marcescens菌株公布的脂肪酶基因同源性高达94-99％; lipA基因编码614个氨基酸，分子量为65 kDa，与其他S.marcescens菌株公布的脂肪酶至少有2个氨基酸的差异。通过软件成功对该脂肪酶蛋白的二级和三级结构进行预测，结果发现该蛋白质的中后段即第484-539个氨基酸残基处为该蛋白的保守区。将lipA基因分别插入表达载体pET-21b及pET-22b转化入E.coli BL21(DE3)，结果发现lipA在pET-21b中多表达为无活性的包涵体，在pET-22b中表达为有活性的可溶蛋白。产酶条件优化后结果表明含有重组质粒pET-21b-lipA和pET-22b-lipA的阳性转化子用IPTG诱导lipA表达的最适条件分别为25℃，3h和30℃，5h。pET-22b-lipA诱导后总酶活可达6.6 U/mL，较原始菌株提高了2.5倍。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 脂肪酶概述

1．2 脂肪酶的分子结构和催化特性

1．3 脂肪酶的来源

1．4 脂肪酶的应用

1．4．1 清洁剂工业

1．4．2 食品工业

1．4．3 纤维及造纸工业

1．4．4 生物能源方面

1．4．5 制药工业

1．4．6 生物感应器工业

1．4．7 酿酒业

1．5 产脂肪酶条件的优化

1．6 脂肪酶基因的表达

1．7 本研究的意义和主要内容

1．7．1 本研究的意义

1．7．2 本实验的研究内容

2 脂肪酶菌株的筛选，分离及鉴定

2．1 试验材料

2．2 土样采集

2．3 主要培养基及试剂的配制

2．4 仪器设备

2．5 试验方法

2．5．1 产酶菌株的筛选

2．5．2 Lipa1318粗酶液的性质

2．5．3 产脂肪酶菌株的鉴定

2．6 结果与分析

2．6．1 产脂肪酶菌株的分离及筛选结果

2．6．2 Lipa1318粗酶液的性质

2．6．3 菌株Lipa1318的形态及生理生化鉴定

2．6．4 菌株Lipa1318的16S rDNA鉴定

2．7 讨论

3 菌株Lipa1318发酵条件的优化

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．2．1 单次单因子法设计

3．2．2 响应面法设计进一步优化发酵条件

3．3 结果与分析

3．3．1 单因子分析

3．3．2 响应面优化产酶条件

3．4 讨论

4 脂肪酶基因的克隆及表达

4．1试验材料

4．1．1 培养基及相关试剂的配置

4．2 脂肪酶基因的克隆

4．2．1 脂肪酶基因寡核苷酸引物的设计合成

4．2．2 脂肪酶基因的获得

4．2．3 重组质粒pET-21b-lipA及pET-22b-lipA的构建

4．2．4 重组质粒pET-21b-lipA及pET-22b-lipA的转化及表达

4．3 结果与分析

4．3．1 脂肪酶基因测序结果

4．3．2 脂肪酶基因序列的分析

4．3．3 编码蛋白的预测及分析

4．3．4 重组质粒pET-21b-lipA及pET-22b-lipA的构建及诱导表达

4．4 讨论

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

硕士期间发表学术论文

作者简介

致谢