人脂肪干细胞生长特性的观察和一步法冻存细胞的可行性研究

摘要

背景：人脂肪干细胞(hADSCs)是Zuk PA等[1]于2001年首次从人抽脂术中脂肪组织悬液中获得，以其组织来源丰富、取材方便、创伤小，易体外分离培养、增殖稳定，有多向分化潜能等特点[2-5]，为未来科研和临床提供了广阔的应用前景，成为继骨髓间充质干细胞(BMSCs)之后又一研究热点[6]。目前对于hADSCs体外培养生长特性和冻存、复苏细胞的方法研究较少，极大限制了hADSCs的深入研究和临床应用。
　　 目的：观察hADSCs体外培养不同时期的形态特征与生长特性，并对比探索以-70℃一步法冻存细胞的可行性。进一步认识hADSCs体外培养中的生长规律和细胞生物学表型特点，优化冻存方法，为以hADSCs为种子细胞的临床干细胞移植研究奠定基础。
　　 方法：于术中取患者皮下脂肪组织3～5 g，胶原酶消化法体外分离获取hADSCs，应用含20％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基行原代及传代培养。观察不同传代时期(P1、P3…P15)细胞形态特征和生长特性，检测增殖力(细胞计数法)，绘制细胞生长曲线，计算群体倍增时间(PTD)。取生长良好的P5细胞，应用流式细胞仪，采用“排除法”鉴定细胞表面抗原表达类型。取处指数生长期P5细胞，利用“10％DMSO+40％FBS+50％DMEM/F12”细胞冻存保护液，分别行-70℃一步法冻存及常规-70℃冻存，于3d和30d后复苏细胞。对比-70℃一步法冻存及常规-70℃冻存后复苏细胞的活力(台盼蓝拒染法)及培养中的形态特征和生长特性，检测复苏细胞首次传代培养后的增殖力(MTT比色法)，且与冻存前细胞比较。
　　 结果：原代培养细胞形态不一，增殖缓慢；传代后形态逐步趋于一致。P1细胞含有部分异型细胞，且增值稍缓慢，PTD约75h；P3后细胞形态均一，增殖旺盛，PTD约64h；P11后细胞增殖速度迅速减慢，P13后细胞呈现衰老特征，PTD约85h。hADSCs表型鉴定提示：CD29、CD44阳性表达，CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，符合间充质干细胞表面分子表达特点。-70℃一步法冻存和常规-70℃冻存3d及30d后复苏细胞的成活率可达91％左右，复苏后初种植细胞贴壁时间较冻存前延长并伴有少部分细胞死亡，生长较缓慢，传代培养后呈现旺盛增殖，细胞形态和生长特性与冻存前一致。-70℃一步法冻存和常规-70℃冻存3d及30d后复苏细胞活力比较，差异无统计学意义(P>0.05)；但与冻存前细胞活力比较，差异有统计学意义(P<0.01)。-70℃一步法冻存和常规-70℃冻存后复苏细胞传代培养中增殖力比较差异无统计学意义(P>0.05)，且与未冻存细胞增值力比较差异也无统计学意义(P>0.05)。
　　 结论：1人脂肪干细胞适宜体外分离与培养，不同生长时期细胞形态特征及生长特性有差别；2人脂肪干细胞表面抗原鉴定结果符合间充质干细胞表面分子表达特征；3-70℃一步法冻存体系可以在一定时期内很好保持细胞的活力与增值力，是超低温保存人脂肪干细胞的理想方案。