河北保定地区PCV2遗传变异及血清抗体水平与病毒血症的关系

摘要

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2，PCV2)可导致猪免疫功能损伤，其引起的猪圆环病毒相关疾病（PCV2-associated diseases，PCVAD）给世界养猪业造成了重大经济损失。从发现PCV2对猪具有致病性以来，其基因型不断发生变化，迄今至少有PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d四种基因型。不同地区流行的PCV2优势基因型存在差异，而且PCV2的致病力与基因型有关。近年来有研究报道河北地区存在PCVd型，但保定地区PCV2的遗传变异特征尚无系统资料。本研究旨在明确保定地区PCV2的遗传变异特征，分析血清PCV2特异性ELISA抗体与病毒血症的相关性，丰富当地PCV2分子流行病学资料，为PCV2的有效防制与免疫效果评价提供参考。
　　本实验于2015～2016年间从保定地区53家猪场采集了699份血清，16份组织样本，应用PCR扩增PCV2全基因组序列，从来自32家猪场的70份样品中检测到了病毒核酸，选取24份样品进行全基因组序列测序与分析。24条序列中仅1条长度为1768bp，其余23条长度均为1767bp。24条序列间核苷酸序列同源性在95％～99％之间。基于全基因组和PCV2ORF2序列，应用MEGA6.0软件对24条核苷酸序列和氨基酸序列绘制了遗传进化树。24条序列中一条为PCV2a型，一条为PCV2b型，其余22条均为PCV2d型，所占比例高达91.7％。三种流行的基因型在核苷酸和氨基酸序列上均存在较大差异，尤其是ORF2的变异最为显著。将22条PCV2d基因型序列与8条参考序列进行比对，发现在ORF2的167位氨基酸存在甘氨酸(G)或精氨酸(R)的突变，本实验测定的PCV2d序列中有90.9％(20/22)是甘氨酸，而在以往的参考序列中有87.5％(7/8)是精氨酸(R)。该研究结果表明2015～2016年间保定地区流行的PCV2主要为PCV2d基因型，并且PCV2d之间也在发生变化。
　　应用ELISA和PCR分别检测了368份血清样品的PCV2特异性抗体和病毒核酸，结果抗体阳性率51.36％(189/368)，病毒核酸阳性率为17.39％(64/368)。按照抗体水平将检测的血清样品分为六个梯度组，采用Spearman相关分析法，分析每组PCV2阳性率与特异抗体之间的相关性，两者的相关系数-0.464，而P=0.354。结果表明，猪血清中PCV2携带率与特异性ELISA抗体水平之间不相关，提示不能以血清抗体水平来判断猪的病毒血症状态。
　　综上所述，当前保定地区猪场流行的PCV2有PCV2a、PCV2b和PCV2d三个基因型，其中PCV2d为优势基因型;血清PCV2阳性率与特异性ELISA抗体水平之间无相关性，不能以血清抗体水平来判断猪的病毒血症状态。

目录

声明

摘要

英文缩写表

1．1 PCV2研究概况

1．1．1 PCV2的基因型划分

1．1．2 PCV2的流行现状

1．2 病毒编码的主要蛋白

1．2．1 ORF1编码的蛋白

1．2．2 ORF2基因编码的蛋白

1．2．3 ORF3编码的蛋白

1．2．4 ORF4～ORF11编码的蛋白

1．2．5 PCV2复制及损伤机理

1．3 PCV2的免疫防控

1．3．1 PCV2在猪群中的传播

1．3．2 病毒血症对PCV2感染的影响

1．3．3 免疫对PCV2感染的影响

1．3．4 PCV2疫苗发展趋势

1．4 研究内容

1．5 研究目的与意义

1．6 研究目标

2．1 血清与组织

2．2 引物

2．3 试剂盒

2．4 主要试剂

2．4．1 病毒DNA及质粒提取用试剂

2．4．2 琼脂糖凝胶电泳用溶液

2．4．3 大肠杆菌DH5α感受态细胞制备及质粒转化所用试剂

2．4．4 其他试剂

2．5 主要仪器

3．1．1 组织处理

3．1．2 DNA提取

3．2 PCR

3．2．1 病毒全基因组扩增体系及扩增条件

3．2．2 PCR纯化回收

3．3 PCV2基因的克隆

3．3．2 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

3．3．3 连接产物的转化

3．3．4 重组质粒DNA的提取

3．3．5 重组质粒的鉴定及序列测定

3．4 病毒的遗传变异分析

3．4．1 测序样本

3．4．2 遗传变异分析

3．5 血清抗体的ELISA

3．6 血清特异ELISA抗体与病毒血症的关系分析

4．1 病毒检出率

4．2 PCV2的遗传变异分析

4．2．1 基于PCV2全基因组的遗传变异分析

4．2．2 基于PCV1 ORF1的遗传变异分析

4．2．3 基于PCV2 ORF2的遗传变异分析

4．2．4 基于PCV2 ORF3的遗传变异分析

4．3 血清特异抗体阳性率

4．4 病毒血症与血清特异抗体的相关性分析

5 讨论

5．1 保定市可能的PCV2流行状况

5．2 PCV2遗传进化分析与优势基因型

5．3 抗体与病毒血症的关系

6 结论

参考文献

在读期间发表的学术论文与获得的研究成果

作者简介

致谢

附录