转基因农作物精准检测及生物安全评价技术研究

摘要

目前，我国的转基因农作物检测技术研究还停留在以PCR技术为核心的核酸序列检测阶段，而生物安全评价技术研究处于田间试验和室内动物试验阶段，缺乏行之有效的转基因作物精准检测和生物安全评价方法用于指导生产实践。本研究以目前我国主要进口作为加工原料的转基因玉米、大豆以及我国自主研发的尚未商业化种植的抗虫转基因水稻为研究材料，分别在基因组、转录组以及代谢组水平，利用核酸等温扩增技术、焦磷酸测序技术、miRNA分析技术以及代谢指纹分析技术，开展转基因农作物可视化快速检测技术，高通量筛查技术以及生物安全评价技术。主要研究结果如下:
　　1.建立和完善了转基因抗虫水稻TT51-1可视化等温扩增快速检测技术
　　以Bt基因特异性核酸序列为目标，设计等温扩增反应引物，并对反应体系、反应程序、产物分析方式、特异性和灵敏度等进行优化和确定，结果表明本研究建立的方法特异性与PCR检测方法一致，方法灵敏度是PCR检测方法的10倍，检测效率较常规技术提高了75-90％。
　　2.建立了Bt基因原核表达体系，获得了原核表达蛋白抗体
　　本研究成功从转基因水稻中克隆全长Bt基因至pGEM-T载体，测序验证后利用HindⅢ与BamHI双酶切将Bt基因定向插入pET-28a载体，转化重组构建的pET-28a-cry至BL21宿主菌，在0.1mmol/L IPTG诱导下成功表达并纯化回收分子量约71kD的目的蛋白。使用纯化Bt蛋白免疫动物制备抗体，试验验证抗体效价＞1/300。
　　3.开发出转基因农作物精准Special-base焦磷酸测序检测技术
　　本研究首次创建Special-base焦磷酸测序检测方法，用于精准鉴定转基因作物NOS/plasmid构建特异性以及crylAb目标基因特异性，该方法有望成为转基因检测和鉴定的黄金标准。本研究以转基因作物中常见的NOS/plasmid构建和crylAb基因为靶标，以转基因大豆GTS-40-3-2、转基因玉米GA21、NK603、Bt11、Bt176和MON810等转基因作物为试验材料，针对NOS/plasmid构建特异性和crylAb基因特异性序列设计引物，经复合PCR扩增及焦磷酸测序，建立Special-base焦磷酸测序模型，该技术提高了转基因作物检测的精准性、检测通量和自动化程度。
　　4.建立了转基因抗虫水稻与其非转基因受体在代谢产物上差异性分析方法
　　优化了水稻代谢物提取方法，建立了完整的水稻样本制备方法和仪器的数据采集方法。试验最终得到优化的样本预处理方法，水稻样本经液氮冷冻粉碎后称取100mg于2mL的离心管中，加入提取溶剂(甲醇:水=80∶20)1mL，涡旋使其混匀，放入高速冷冻离心机中，16000g(4。C)离心15min，取400μL上清液，即得。试验结果表明，主要差异表现在幼苗期“+”模式下共鉴定到4个化合物，分别为MDB32906、HMDB02060、HMDB35482和HMDB32784，“一”模式下，4.73491.1927m/z化合物;分蘖期“+”模式下差异最大的化合物是HMDB38469，“一”模式下，差异最大的化合物是1.10_579.137m/z，但是转基因水稻与其非转基因受体之间未发现非预期代谢途径。
　　5.建立了转基因大豆及其非转基因亲本品系的干种子中的miRNA成分进行差异分析方法
　　利用高通量测序平台对转基因大豆及其非转基因亲本品系的干种子中的miRNA成分进行差异分析。试验结果证实，多个保守的gma-miRNA在不同大豆品系间存在成分差异，包括转基因与非转基因之间，也包括非转基因与非转基因之间。与A3244相比，转基因大豆MON89788中的10个保守miRNA全部下调表达，包括miR1507、miR1510、miR166、miR319、miR390、miR396和miR482家族成员，其中下调幅度最大的是gma-miR166a-3p和gma-miR166h-3p。miR166的功能是通过调控Homeodomainleucine zipper(HD-ZIP)基因从而影响苗期发育。在转基因大豆DP-3(O)5423×GTS40-3-2与非转基因大豆Jack之间存在3个保守gma-miRNA差异表达，其中miR482c-3p下调表达，miR398c和miR1511上调表达。值得注意的是在两个非转基因大豆之间共发现了13个差异表达的保守gma-miRNA，这些gma-miRNA的ID不同，变化趋势也不一样。这些结果说明，不同大豆品种之间确实存在miRNA成分差异，但这种差异很可能是与亲缘关系远近直接相关的。

目录

声明

摘要

第一章 引言

1．1 转基因作物的发展现状

1．2 转基因作物及其产品的安全性

1．3 转基因作物及其产品的检测方法

1．3．1 转基因作物及其产品PCR检测策略

1．3．2 基因芯片检测技术方法(Gene chip)

1．3．3 复合PCR检测技术方法(Multiplex PCR)

1．3．4 核酸等温扩增技术(Isothermal amplification)

1．3．5 生物传感器检测技术(Biosensor)

1．3．6 高通量测序技术(High-throughput sequencing)

1．3．7 转基因作物及其产品的定量检测方法

1．4 转基因生物安全评价内容和方法

1．4．1 代谢组学及其在转基因生物安全评价中的应用

1．4．2 miRNA在转基因生物安全评价中的应用

1．5 立题依据与研究目标

第二章 抗虫转基因水稻TT51-1可视化快速检测技术研究

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 主要试验试剂和仪器

2．1．3 试验方法

2．2 结果与分析

2．2．1 可视化LAMP反应条件优化

2．2．2 可视化LAMP反应实时浊度检测

2．2．3 可视化LAMP反应特异性

2．2．4 可视化LAMP反应灵敏度

第三章 转基因水稻TT51-1抗虫基因克隆与原核表达

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要试剂和仪器

3．1．3 试验方法

3．2 结果与分析

3．2．2 原核表达载体构建及鉴定

3．2．3 目的基因原核表达与纯化

3．2．4 蛋白抗原表位预测

3．2．5 重组蛋白特异性鉴定

3．2．6 抗体效价检测

第四章 Special-base转基因检测方法的建立

4．1 材料与方法

4．1．1 试验材料

4．1．2 试验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 基因序列比对

4．2．2 焦磷酸测序用基因特异性序列引物设计和优化

4．2．3 crylAb基因特异性Special-base焦磷酸测序检测模型建立

4．2．4 NOS/plasmid 构建特异性Special-base 焦磷酸测序检测模型的建立

4．2．5 方法验证

第五章 基于代谢组学转基因作物与受体差异性分析研究

5．1 材料和方法

5．1．1 试验材料

5．1．2 主要试剂和仪器

5．1．3 试验方法

5．2 结果与分析

5．2．1 色谱柱的选择

5．2．2 提取试剂浓度的优化

5．2．3 试验数据的统计学分析

5．2．4 色谱图分析方法的优化

5．2．5 幼苗期代谢指纹谱的代谢组学分析

5．2．6 分蘖期代谢指纹谱的代谢组学分析

第六章 基于miRNA转基因作物与受体差异性分析研究

6．1 材料和方法

6．1．1 试验材料

6．1．2 主要试剂

6．1．3 试验方法

6．2 结果与分析

6．2．1 小分子RNA高通量测序文库概况

6．2．2 保守miRNA的表达差异分析

6．2．3 Novel miRNA的预测分析

第七章 讨论

7．2 转基因水稻TT5 1-1抗虫基因克隆与原核表达

7．3 Special-base转基因检测方法

7．4 基于代谢组学转基因作物与受体差异性分析研究

7．5 基于miRNA转基因作物与受体差异性分析研究

第八章 结论

参考文献

博士在读期间发表的学位论文

作者简历

致谢

数字PCR在转基因水稻拷贝数鉴定中的应用研究

Comparative Profiling of microRNA Expression in Soybean Seeds from Genetically Mdified Plants and their Near-Isogenic Parental Lines

Developament of the One-step Visual Loop-Mediatd Isothermal Amplification Assay for Genetically Modified Rice Event TT51-1

转基因大豆GTS40-3-2成分现场可视化检测方法的建立