苹果树腐烂病初始接种体来源与病菌扩展的定量研究

摘要

苹果树腐烂病(apple tree Valsa canker)是我国各主要苹果产区普遍发生且危害严重的一种真菌病害，该病害由苹果树腐烂病菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)）引起。本研究首先建立了苹果树腐烂病菌实时荧光定量PCR检测体系，并应用该体系从量化的角度检测了八棱海棠种子、八棱海棠幼苗和苹果品种接穗携带苹果树腐烂病菌的带菌率和带菌量。通过人工接种和检测，明确了苹果树腐烂病菌在枝条韧皮部和木质部的扩展情况。主要研究结果如下:
　　1.首次建立了苹果树腐烂病菌实时荧光定量PCR检测体系:20μL反应体系中，引物VE-F和VE-R各0.5μL，模板DNA1.0μL，含荧光染料的Mix10.0μL，ddH2O8.0μL;反应条件为:95℃预变性300s，95℃变性12s，58.0℃退火12s，72℃延伸14s，40个循环;罗氏Light Cycler96仪器生成的溶解曲线程序是95℃10s，65℃60s(2.20℃/s),97℃1s(0.20℃/s)。
　　2.苹果砧木八棱海棠的种子普遍携带苹果树腐烂病菌。张家口怀来、江苏沐阳、云南丽江和河北保定4个地区生产的海棠种子带菌率分别为:12.87％、44.55％、22.19％和49.01％，平均带菌量分别为5.79×102copies/g、2.76×103copies/g、7.74×102copies/g和4.68×102copies/g。病菌集中于内外种皮，子叶和胚芽未检测到病菌。
　　3.海棠种子出芽后的快速生长过程中，其携带腐烂病菌的带菌率和带菌量均呈现增长趋势。种子、2叶苗、4叶苗和8叶苗的平均带菌率分别为12.87％、43.33％、50.00％和60.12％，平均带菌量为5.79×102copies/g、8.82×103copies/g、5.88×104copies/g和1.39×105copies/g。8叶期后，海棠苗中腐烂病菌含量稳定在1.30×105copies/g左右。
　　4.发生腐烂病的果树果实中的苹果种子与健康果树上的苹果种子相比，携带苹果树腐烂病菌情况存在显著性差异。病树果实种子的平均带菌率为10.00％，平均带菌量为2.0×102copies/粒，而健康苹果树的果实种子中未检测到腐烂病菌。
　　5.河北蠡县接穗圃的富士接穗韧皮部和木质部中苹果树腐烂病菌的平均带菌率分别为68.88％和76.67％，平均带菌量分别为3.14×104copies/g和6.28×104copies/g。
　　6.室温（约18℃）条件下人工接种苹果树腐烂病菌于40根3年生苹果枝条，接种21d后，韧皮部病斑向枝条端部和基部扩展的平均距离分别为6.31cm和4.53cm，而病菌的平均扩展距离分别为13.0cm和14.3cm;木质部褐变组织向枝条端部和基部扩展的平均距离分别为11.33cm和12.33cm，病菌的平均扩展距离分别为13.33cm和16.33cm。病菌在韧皮部和木质部的扩展距离显著大于其病斑的扩展距离;木质部褐变组织的扩展距离显著大于韧皮部病斑的扩展距离;病健交界处发病部位与未发病部位的菌量存在显著性差异，发病部分平均带菌量为1.0×107copies/g，而健康部分平均带菌量仅为5.0×104copies/g。
　　本研究首次建立了苹果树腐烂病菌实时荧光定量PCR检测体系，并利用这一检测体系证明了苹果砧木（八棱海棠）种子、苹果砧木（八棱海棠）幼苗和接穗普遍携带苹果树腐烂病菌，明确了腐烂病菌接种后的离体枝条上病菌的扩展距离，为深入研究苹果树腐烂病菌的侵染奠定基础，为病害防控提供理论指导。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 苹果树腐烂病概述

1．2 病原及其生物学特性

1．2．1 病原

1．2．2 病原的生物学特性和遗传分化

1．3．1 病菌的侵染来源和传播

1．3．2 苹果腐烂病菌具潜伏侵染特性

1．3．3 病菌的侵入和发病

1．4 苹果树腐烂病的扩展研究

1．4．1 苹果树腐烂病韧皮部病斑扩展

1．4．2 木质部病斑扩展研究

1．4．3 病菌在树体的扩展研究

1．5 苹果病害检测方法研究

1．5．1 传统检测技术

1．5．2 分子生物学检测方法

1．5．3 实时荧光定量PCR检测技术

1．5．4 实时荧光定量PCR植物病害流行研究中的应用

1．6 本研究的目的与意义

2．1．1 供试病原菌

2．1．2 供试培养基

2．1．3 试验仪器和试剂

2．2 试验方法

2．2．1 苹果腐烂病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立

2．2．2 苹果树腐烂病菌接种体来源的研究

2．2．3 腐烂病菌在离体苹果枝条木质部和韧皮部扩展情况的定量检测

3 结果与分析

3．1 实时荧光定量PCR检测体系的建立与优化

3．1．1 qPCR引物筛选及特异性验证

3．1．2 qPCR检测体系的优化

3．1．3 苹果树腐烂病菌实时荧光定量PCR检测体系

3．1．4 qPCR检测体系的灵敏度

3．1．5 标准曲线

3．2 新建苹果园或健康苹果树上苹果树腐烂病的接种体来源

3．2．1 不同地区海棠种子携带腐烂病菌情况检测

3．2．2 海棠种子各部分携带腐烂病菌情况检测

3．2．3 不同时期海棠苗携带腐烂病菌情况

3．2．4 河北蠡县富士接穗圃一年生枝条携带腐烂病菌检测

3．2．5 苹果果实种子携带腐烂病菌情况比较

3．3 人工接种条件下腐烂病菌在离体苹果枝条的扩展情况

4 讨论

4．1 苹果树腐烂病菌实时荧光定量PCR检测体系的建立

4．2 关于苹果树腐烂病菌的接种体来源

4．3 病菌扩展与防治

5 结论

参考文献

在读期间被录用和发表的学术论文

作者简介

致谢