苹果树腐烂病菌Dicer2依赖的small RNAs鉴定及Vm-milRNA6调控病菌致病的机理分析

摘要

苹果在我国果业中占有重要地位，其产业关乎区域经济增长和果农的脱贫致富。然而由黑腐皮壳属真菌Valsa mali侵染引起的苹果树腐烂病却严重影响我国苹果产业的健康可持续发展。加快解析病菌致病机理对针对性防控策略的制定和病害的持久有效控制具有重要意义。近年研究表明，milRNAs在病原菌对植物的侵染过程中起着关键作用，但苹果树腐烂病菌milRNAs在转录后水平调控病菌与寄主互作的机理尚未明确。前期研究发现苹果树腐烂病菌存在RNAi通路关键蛋白，且在病菌的致病过程中发挥重要作用，特别是Dicer2缺失以后，病菌的致病力显著降低。为此，本研究利用small RNA测序技术、降解组测序技术、基因敲除及烟草共转化等试验分析了差异sRNAs，鉴定了milRNAs靶基因，并且明确了milRNA与靶基因的调控关系，进而对两者进行功能分析。研究结果为全面揭示milRNAs调控苹果树腐烂病菌致病机理奠定了重要基础。主要结果如下： 1、分别构建了苹果树腐烂病菌菌丝体（MVm）与Dicer2突变体菌丝体（MD2）sRNA文库。去掉垃圾序列后，在MVm和MD2中分别分析获得sRNAs有效序列1023889条和593982条。分析发现，VmDCL2的缺失也会对siRNAs的生成产生显著影响，进而发现在MVm和MD2中milRNAs的表达存在显著差异。利用降解组深度测序技术，构建了苹果树腐烂病菌菌丝体（TMVm）与Dicer2突变体菌丝体降解组库（TMD2），共筛选获得11个Dicer2依赖的milRNAs对应的靶标基因。 2、对Vm-milRNA6的前体序列进行敲除，共获得4个敲除突变体（△6-1-22、△6-1-27、△6-2-18和△6-2-25）。对野生型菌株和敲除突变体进行观察比较，发现其菌落均表现为白色，近圆形，但敲除突变体的菌落直径显著减小，致病力显著增强。根据降解组测序、功能注释及生物信息学分析，鉴定VPS10为Vm-milRNA6的关键候选靶基因。进而将Vm-milRNA6前体和靶基因VPS10共转化入烟草叶片中结果显示，VPS10单独注射的烟草叶片，在细胞膜上观察到明显的绿色荧光；当Vm-milRNA6前体和VPS10共表达时，绿色荧光显著减少，说明Vm-milRNA6对VPS10确实有靶向切割作用，Western Blot进一步证实共转化之后GFP的表达量显著降低。由此表明Vm-milRNA6与靶基因VPS10存在调控关系。进而对VPS10进行敲除，共获得2个敲除突变体（△2-2-37和△2-2-44）。敲除突变体菌株与野生型菌株相比，菌落形态一致，但菌落直径显著减小，致病力显著降低。

目录

声明

主要符号对照表

第一章 文献综述

1.1.1 苹果树腐烂病的发生

1.1.2 苹果树腐烂病的危害

1.1.3 苹果树腐烂病菌致病机理研究

1.2 RNAi

1.2.1 RNAi概念及核心组件

1.2.2small RNAs的产生及作用机制

1.2.3 真菌sRNAs的产生机制

1.2.4 真菌milRNAs的功能研究

1.3 技术路线

1.4 本研究的目的及意义

第二章苹果树腐烂病菌中Dicer2依赖的small RNAs的分离鉴定以及milRNA调控网络分析

2.1.1 材料

2.1.2 主要试剂、耗材与培养基

2.1.3 仪器

2.1.4 样品采集

2.1.5 总RNA的提取与纯化

2.1.6野生型菌株与Dicer2突变体的small RNA文库构建

2.1.7 野生型菌株与Dicer2突变体中miRNAs差异表达分析

2.1.8 降解组测序、靶基因鉴定及功能分析

2.2 结果分析

2.2.1small RNAs测序数据分析

2.2.2野生型菌株与Dicer2突变体的small RNAs差异表达分析

2.2.3 靶基因生物学功能分析

2.2.4 降解组测序鉴定Dicer2依赖的milRNAs的靶基因

2.3 结论与讨论

第三章 Dicer2依赖的Vm-milRNA6功能及其调控病菌致病力的机理

3.1.1 材料

3.1.2 主要试剂、耗材与培养基

3.1.3 仪器

3.1.4 Vm-milRNA6前体敲除载体的构建

3.1.5 Vm-milRNA6前体敲除

3.1.6 转化子PCR检测

3.1.7 敲除突变体的表型观察

3.1.8 烟草共转化

3.1.9Western Blot杂交

3.1.10 靶基因VPS10敲除载体的构建

3.1.11 靶基因VPS10敲除

3.1.12 转化子PCR检测

3.1.13 敲除突变体的表型观察

3.2 结果分析

3.2.1 Vm-milRNA6功能分析

3.2.2 Vm-milRNA6-与靶基因VPS10调控关系的验证

3.2.3 靶基因VPS10功能分析

3.3 结论与讨论

第四章 全文总结

附录I

附录II:试剂及培养基

参考文献

致谢

个人简历