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目 录
第一章 文献综述
1.1.1 植物免疫系统
1.2.2 植物模式识别受体在植物病原菌-寄主互作中的研究进展
1.2.3 植物 PTI和 ETI引起的基因表达变化及生理生化反应
1.2 植物病原真菌致病基因
1.2.1 参与宿主的识别和信号传导的相关基因
1.2.2 细胞壁降解酶基因
1.2.3 真菌次生代谢相关基因
1.2.4 效应蛋白编码基因
1.3 动植物 RNA干扰及小 RNA研究
1.3.1 RNA干扰的发现、作用及小 RNA的种类
1.3.2 动植物小 RNA的产生及作用方式
1.3.3 植物小 RNA调控内源基因参与植物免疫反应
1.3.4 植物小 RNA跨界调控病菌致病相关基因
1.4.1 真菌 RNAi的发现及作用
1.4.2 真菌小 RNA种类及作用
1.4.3 真菌 RNAi的作用方式
1.4.4 真菌小 RNA在植物病原真菌致病中的作用
1.5.1 苹果树腐烂病的发生
1.5.2 苹果树腐烂病的病原病原及病害发生规律
1.5.3 苹果树腐烂病菌致病机制研究
1.6 本研究的目的和意义
第二章 苹果树腐烂病菌milRNA 及其靶标基因的鉴定
2.1 引言
2.2.1 试验菌株、植物及载体
2.2.2 试剂
2.2.3 仪器与软件
2.3 试验方法
2.3.1 测序样品准备
2.3.1 小 RNA测序文库的构建及测序
2.3.3 小 RNA测序结果分析、苹果树腐烂病菌 milRNA的鉴定
2.3.4 苹果树腐烂病菌 milRNA表达分析
2.3.5 苹果树腐烂病菌 milRNA靶标基因的预测
2.3.6 降解组测序及数据分析
2.3.7 Vm-milRNA和候选靶标基因read的标准化及共表达分析
2.3.8 鉴定候选靶标基因中的致病相关基因
2.4 结果与分析
2.4.1 小 RNA测序结果概述
2.4.2 苹果树腐烂病菌 milRNA的鉴定及特征分析差异表达分析
2.4.3 苹果树腐烂病菌 microRNA-like RNA的差异表达分析
2.4.4 苹果树腐烂病菌 milRNA靶标基因的初步鉴定
2.4.5 苹果树腐烂病菌 milRNA候选靶标基因功能富集分析
2.4.6 苹果树腐烂病菌 milRNA候选靶标基因中候选致病相关基因的
2.4.7 苹果树腐烂病菌 milRNA与候选靶标基因的共表达分析
2.5 讨论
第三章 苹果树腐烂病菌 milRNA适应性调控病菌致病因子
3.1 引言
3.2.1 试验菌株、植物及载体
3.2.2 试剂
3.2.3 仪器
3.3 试验方法
3.3.1 苹果树腐烂病菌菌丝体与病菌-寄主互作样品总 RNA的提取
3.3.2 颈环实时定量 PCR检测 Vm-milRNA的表达模式
3.3.3 实时定量 PCR检测 Pri-milRNA与基因表达模式
3.3.4 苹果树腐烂病菌基因组 DNA的提取
3.3.5 琼脂糖凝胶回收
3.3.6 大肠杆菌转化
3.3.7 质粒提取
3.3.8 Vm-milRNA过表达载体的构建及点突变载体的构建
3.3.9 蛋白序列比对与进化树构建
3.3.10 目的基因/片段敲除载体的构建
3.3.11 苹果树腐烂病菌遗传转化体系
3.3.12 苹果树腐烂病菌过表达转化子和敲除突变体的检测
3.3.13 苹果树腐烂病菌营养生长速率、致病力及生物量测定
3.3.14 苹果枝条接种组织学观察
3.3.15 过氧化氢胁迫敏感性与苹果叶片 ROS检测
3.3.16 果胶酶活性测定
3.4.1 Vm-milRNA前体的扩增
3.4.2 Vm-milRNA过表达载体的构建
3.4.3 Vm-milRNA过表达转化株的构建及其致病力评价
3.4.4 Vm-milR16靶标基因的筛选
3.4.5 Vm-milR16以序列特异性的方式参与调控靶标基因的表达
3.4.6 Vm-milR16靶标基因敲除突变体的获得
3.4.7 VmSNF1, VmDODA和 VmHy1 为病菌致病相关基因
3.4.8 Vm-milR16过表达转化株及其靶标基因敲除突变体定殖寄主树
3.4.9 Vm-milR16的靶标基因参与病菌氧化胁迫应答
3.4.10 VmSNF1参与调控果胶酶基因的表达
3.4.11 苹果树腐烂病菌milRNA适应性调控病菌致病相关基因的表达促进病菌侵染的模式
3.5 讨论
第四章 Vm-milR16 通过调控效应蛋白基因VmSP1 的表达影响病菌的侵染
4.1 引言
4.2 试验材料、试剂及仪器
4.2.1 试验菌株、植物材料及载体
4.2.2 试剂
4.2.3 仪器
4.3 试验方法
4.3.1 5’ RLM-RACE鉴定 milRNA靶标基因的切割位点
4.3.2 蛋白序列生物信息学分析
4.3.3 靶标基因表达分析
4.3.4 信号肽外泌功能的验证
4.3.5 靶标基因的敲除和互补
4.3.6 营养生长速率和致病力测定
4.4 结果与分析
4.4.1 降解组测序鉴定 VM1G_10102为 Vm-milR16的靶标基因
4.4.2 5’ RLM-RACE鉴定 VM1G_10102转录本切割位点
4.4.3 Vm-milR16以序列特异性的方式抑制 VM1G_10102的表达
4.4.4 VM1G_10102编码的蛋白为外泌蛋白
4.4.5 VmSP1 系统发育分析
4.4.6 VmSP1为病菌致病相关基因
4.5 讨论
第五章 Vm-milR1 跨界抑制寄主类受体蛋白激酶基因的表达抑制寄主的免疫并促进病菌侵染
5.1 引言
5.2.1 试验菌株、植物材料及载体
5.2.2 试剂
5.2.3 仪器
5.3 试验方法
5.2.1 RNA提取、milRNA和基因的相对定量分析
5.2.2 Vm-milR1的前体序列敲除和敲除突变体的检测
5.2.3 Vm-milR1前体序列敲除突变体检测 Vm-milR1的表达情况
5.2.4 营养生长和致病力测定及组织学观察
5.2.5 苹果和本氏烟叶片 ROS和胼胝质的检测
5.2.6 跨界预测 milRNA的靶标基因
5.2.7 利用烟草共转化技术分析 Vm-milR1对靶标基因的调控作用
5.2.8 苹果基因在本氏烟上的瞬时表达和免疫反应的检测
5.2.9 农杆菌介导的苹果叶片瞬时转化
5.4 结果与分析
5.4.1 Vm-milR1的鉴定及表达分析
5.4.2 Vm-milR1的前体是 Vm-milR1产生所必需的
5.4.3 Vm-milR1为腐烂病菌重要的致病因子
5.4.4 接种 Vm-milR1前体敲除突变体诱导寄主免疫反应
5.4.5 Vm-milR1可能靶向多个苹果类受体蛋白激酶基因
5.4.6 Vm-milR1沉默多个苹果 RLK基因的表达
5.4.7 MdRLKT1 和 MdRLKT2的保守结构域、多序列比对及系统发育分析
5.4.8 MdRLKT1 和 MdRLKT2定位于细胞膜
5.4.9 本氏烟瞬时表达 MdRLKT1和MdRLKT2通过提高植物的PTI反应提高对核盘菌的抗性
5.4.10 过表达 MdRLKT1和 MdRLKT2提高苹果叶片对 V. mali的抗性
5.4.11 Vm-milR1跨界抑制寄主 RLK基因的表达抑制寄主的免疫并促进病菌侵染的模式
5.5 讨论
第六章 全文结论与展望
6.1 全文结论
6.2 展望
参考文献
附 录
附录 1 供试培养基
附录 2 供试试剂配方
附录 3 引物及序列
附录 4 苹果树腐烂病菌候选milRNA前体信息
附录 5 苹果树腐烂病菌候选milRNA及表达水平
附录 6 苹果树腐烂病菌候选milRNA的候选靶标基因
附录 7 候选 milRNA候选靶标基因中致病相关的鉴定
致 谢
作者简介
西北农林科技大学;
