玉米大斑病菌StMSN2基因的功能研究

摘要

本课题组研究发现，玉米大斑病菌HOG-MAPK级联途径中HOG1基因敲除突变体对高渗胁迫的耐受性下降，部分原因是突变体菌丝积累甘油能力下降。△StHOG1对苯基吡咯类杀菌剂和细胞壁合成干扰物质的耐受性大大增强，显微镜观察发现，突变体细胞壁外侧絮状物质消失，细胞壁变得光滑，推测HOG1基因突变影响了菌丝细胞壁的发育，但是细胞壁的这种变化与病菌对苯基吡咯类杀菌剂和细胞壁合成干扰物质耐受性增强是否有关尚不清楚。研究证实HOG1可以磷酸化Sko1，Hot1，Smp1，Msn1，Msn2，Msn4等转录因子，这些转录因子如何调节靶基因的表达尚不清楚。本课题组研究发现，玉米大斑病菌中仅存在一个Msn2的同源蛋白，命名为StMsn2;研究表明，酵母菌MSN2和MSN4双突变体对高渗胁迫的耐受性大大下降，稻瘟病菌MSN2基因敲除突变体不再产生分生孢子，丧失对水稻叶片的致病能力。由此可见Msn2蛋白很可能参与了真菌HOG-MAPK级联途径对高渗胁迫的适应及细胞壁发育和致病性的调控。但是Msn2蛋白是否参与真菌对苯基吡咯类杀菌剂和细胞壁合成干扰物质的耐受性调控尚不清楚。在此基础上，我们利用农杆菌介导的转化技术，获得了2株玉米大斑病菌StMSN2基因敲除突变体;并对该突变体的生长发育，对高渗胁迫的耐受性，对苯基吡咯类杀菌剂和细胞壁合成干扰物质的耐受性及病菌的致病性进行了研究。主要研究结果如下:
　　1.获得了2株StMSN2基因敲除突变体。以pBS-PUC及pPZP100载体为基本骨架、潮霉素抗性基因(HPH)作为筛选标记，成功构建了玉米大斑病菌StMSN2基因敲除载体。利用农杆菌介导的ATMT转化技术，转化玉米大斑病菌01-23的野生型菌株，然后经过潮霉素抗性筛选、特异引物PCR、RT-PCR、southern blotting验证，最终得到2株StMSN2基因敲除突变体，将其命名为△StMSN2-1、△StMSN2-2。
　　2.StMSN2基因突变影响了病菌的生长发育及致病性。2株△StMSN2-1，△StMSN2-2基因敲除突变体在PDA培养上菌落生长速率较野生型增大，菌落颜色变浅，突变体不再产生分生孢子。光学显微镜观察发现:突变体菌丝细胞较野生型明显变长，大约是野生型细胞长度的3.2倍，突变体菌丝较野生型黑色素含量显著下降。StMSN2基因缺失使突变体菌丝分化出附着胞的时间大大延迟，且不能穿透玻璃纸膜，不能侵染完整的玉米叶片，但是，仍然可以侵染表皮受到划伤的玉米叶片。
　　3.StMSN2基因突变增强了病菌对细胞壁合成干扰物质的耐受性，同时降低了病菌细胞壁对胞壁裂解酶的抗性。①在CFW和刚果红等细胞壁合成干扰物质处理条件下，突变体菌落生长受抑制程度显著低于野生型;②在细胞壁降解酶的作用下△StMSN2产生的原生质体数量是野生型的1.56倍。
　　4.StMSN2基因突变降低了病菌对高渗胁迫的耐受性。高渗胁迫对野生型菌落生长抑制程度显著高于突变体。0.6M山梨醇对△StMSN2-1、△StMSN2-2与野生型菌株的生长受抑制程度分别为59.6％、60.6％和11.6％;0.4M NaCl对其生长抑制率分别为49.2％、57.5％和30.1％，0.4M KCl对其生长抑制程度分别为51.2％、53.0％和40.1％。
　　5.StMSN2基因敲除突变体对咯菌腈和异菌脲的耐受性没有明显变化，而StHOG1基因敲除突变体对咯菌腈和异菌脲的耐受性显著增强。在35μg/mL异菌脲处理下，WT菌株、StMSN2基因敲除突变体和StHOG1基因敲除突变体的菌落生长受抑制程度分别为100％、100％、100％、7％。在0.75μg/mL咯菌腈处理下，WT菌株、两株StMSN2基因敲除突变体和StHOG1基因敲除突变体的菌落生长受抑制程度分别为80％、82％、77％、9％。

目录

声明

摘要

1．1玉米大斑病及其致病真菌

1．2真核生物锌指结构转录因子概况

1．3植物病原真菌中HOG-MAPK信号转导途径

1．4植物病原真菌Msn2类转录因子的研究进展

1．5本研究的目的和意义

2．1菌株与质粒

2．2试剂与溶液

2．3培养基

2．4仪器与设备

2．5基因结构的生物信息学分析

2．6玉米大斑病菌StMSN2基因敲除载体的构建

2．6．1全基因组DNA的提取

2．6．2 StMSN2基因的侧翼片段序列和潮霉素序列的PCR扩增

2．6．3目的片段的回收、连接与测序

2．6．4 StMSN2基因侧翼片段与基因敲除载体pBluescript Ⅱ SK(-)的拼接

2．6．5 StMSN2-pPZP100敲除载体的构建

2．7农杆菌感受态细胞的转化

2．7．1农杆菌感受态细胞的制备

2．7．2 StMSN2-pPZP100敲除载体转化农杆菌感受态细胞

2．8玉米大斑病菌StMSN2基因敲除突变体的获得与验证

2．8．1农杆菌介导的转化以及筛选

2．8．2 StMSN2基因的敲除策略

2．8．3 StMSN2基因敲除突变体的验证

2．9玉米大斑病菌StMSN2基因的功能分析

2．9．1菌落形态观察与生长速率测定

2．9．2分生孢子产量的测定

2．9．3菌丝形态的显微观察

2．9．4黑色素产量分析

2．9．5病菌细胞壁结构观察及成分测定

2．9．6病菌附着胞发育观察及致病力的测定

2．9．7突变体对不同物质高渗胁迫耐受力分析

2．9．8 StMSN2基因敲除突变体对杀菌剂的反应测定

3结果与分析

3．1 StMSN2基因的生物信息学分析

3．1．1 StMSN2基因在基因组中的定位

3．1．2基因结构

3．1．3蛋白质的理化性质

3．1．4蛋白质的二级结构

3．1．5蛋白质的保守域及功能位点

3．1．6蛋白质的三级结构

3．1．7 StMSN2基因的系统发育

3．2玉米大斑病菌StMSN2基因敲除载体的构建

3．2．1 StMSN2基因侧翼片段的PCR扩增

3．2．2 StMSN2-pBS敲除载体的酶切验证

3．2．3 StMSN2-pPZPl00敲除载体的酶切验证

3．3玉米大斑病菌StMSN2基因敲除突变体的获得

3．3．1突变体的抗性筛选

3．3．2突变体的潮霉素引物验证

3．3．3突变体的特异引物验证

3．3．4突变体的RT-PCR验证

3．3．5突变体的Southern blotting验证

3．4玉米大斑病菌StMSN2基因的功能分析

3．4．1 StMSN2基因对病菌生长发育的影响

3．4．2 StMSN2基因敲除突变体对细胞壁合成干扰物质和胞壁裂解酶的耐受性分析

3．4．3 StMSN2基因对玉米大斑病菌附着胞发育及致病性的影响

3．5 StMSN2基因敲除突变体对高渗胁迫的耐受性

3．6 StMSN2基因敲除突变体对杀菌剂的反应

4讨论

4．1真菌中MSN2基因对其生长发育及致病性的调控作用

4．3 HOG-MAPK级联途径与真菌对苯基吡咯类杀菌剂的耐受性

4．4 HOG-MAPK级联途径与真菌对细胞壁合成干扰物质的耐受性

5结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢