谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株cglI限制修饰系统相关基因的表达及应用

摘要

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）是重要的工业微生物，已经被广泛用于各种氨基酸的工业化生产。目前，代谢工程育种已成为C.glutamicum菌种改造的主要方式。但是C.glutamicum的低转化率成为代谢工程育种的主要障碍之一。影响C.glutamicum转化率的一个重要因素是C.glutamicum菌株中存在限制修饰系统。限制修饰系统(Restriction and Modification system)是指由限制性内切酶和甲基转移酶所组成的单亚基或多亚基的复合酶系统。这两种酶通常是成对出现的，它们具有相同的DNA识别位点，但功能是相反的。限制性内切酶通常作用于DNA的特定位点，造成DNA链的断裂;而甲基转移酶通过对DNA序列的甲基化修饰使得限制性内切酶对该位点不再起作用，从而保护了菌体免受噬菌体和外源DNA的入侵。C.glutamicumATCC13032是C.glutamicum的模式菌株，由R.cglⅠ，M.cglⅠ和H.cglⅠ基因组成的cglⅠ限制修饰系统严重影响其外源DNA的转化效率。为解决C.glutamicum转化率低的问题，本文进行了通过M.cglⅠ基因的染色体整合构建E.coli中间宿主菌的研究;为了解决限制性内切酶基因表达困难的问题，本文进行了严谨控制型表达载体的构建，并对R.cglⅠ进行了表达;本文还探索了H.cglⅠ基因的可替代性。主要研究成果如下:
　　构建了用于基因敲除/敲入的同源重组载体pAU4-Larm-M.cglⅠ-cat-Rarm。选择E.coli染色体gal操纵元3个结构基因gatE(差向异构酶)，galT半乳糖转移酶）和galK半乳糖激酶）中的galT基因作为待替换序列。左臂Lram选自gaiT基因的下游区域，包括gaiT3'末端119bp的DNA序列和终止密码子后的0.79kb的DNA序列。右臂Rarm选自gait基因的上游区域，包括gaiT5'端147bp的DNA序列和gaiT的起始密码子前0.85kb的DNA序列。cat基因用作E.coli整合体的选择标记。通过连续克隆操作实现质粒pAU4与同源左臂Larm、同源右臂Rarm、cat基因和M.cglⅠ基凶的连接。
　　构建了大肠杆菌(Escherichia coli)工程菌株E.coli AU1。将来自于C.glutamicumATCC13032菌株cglⅠ限制修饰系统中编码甲基转移酶的M.cglⅠ基因通过同源重组整合到E.coli TG1基因组上进行表达。通过将不同来源的质粒电转化C.glutamicum ATCC13032来验证M.cglⅠ甲基化对转化率的影响，抽提自E.coli TG1的质粒pAU4转化效率为1.80土0.21×102cfu/μg质粒DNA，而抽提自E.coli AU1的pAU4转化效率达到5.22±0.33×106cfu/μg质粒DNA。结果表明，E.coli AU1能够赋予质粒特异性的M.cglⅠ甲基化模式，使抽提自E.coli AU1的质粒对R.cglⅠ限制性内切酶有抗性并能高效转化C.glutamicum ATCC13032菌株中。
　　构建了严谨控制型E.coli表达载体pAU10。该表达载体利用高效可控制的T7-LacO启动予/操纵子和T7启动子上游的强转录终止子rrnBT2的组合来严格控制极毒基因的转录。此外，与T7启动子方向相反的trp启动子/操纵子产生的反义RNA能阻断渗漏mRNA的翻译。在未添加IPTG和L-色氨酸的情况下，T7启动子高度抑制极毒基因的转录，而trp启动子产生反义RNA，严格阻遏极毒基因的渗漏表达。在培养基中添加IPTG和L-色氨酸后，T7启动子开始有效转录极毒基因，而L-色氨酸的存在使trp启动子关闭不产生反义RNA，这保证了载体在E.coli中高效表达极毒蛋白质。在E.coli中成功表达了限制性内切酶BamHI，表明pAU10是一个优秀的用于表达极毒基因的表达载体。
　　构建了重组质粒pAU10-R.cglⅠ，将重组质粒转化至E.coli JM109(DE3)表达菌株中进行表达。表达后的蛋白质经Western Blot检测大小为40KDa，表明在E.coli中成功表达了限制性内切酶R.cglⅠ。
　　pAU4-R.cglⅠ重组质粒转化E.coli Top10实验，结果并无转化子生长。表明E.coli中具有H.cglⅠ类解旋酶的DEAD家族同源蛋白，其同家族蛋白亦能协助R.cglⅠ蛋白发挥对外源DNA的限制功能。另外，在E.coli中成功进行了H.cglⅠ基因的表达及纯化。

目录

声明

摘要

1．1．1谷氨酸棒杆菌的工业应用

1．1．2谷氨酸棒杆菌的基因工程改造

1．2限制修饰系统简介

1．2．1Ⅰ型限制修饰系统

1．2．2 Ⅱ型限制修饰系统

1．2．3 Ⅲ型限制修饰系统

1．2．4 Ⅳ型限制修饰系统

1．2．5解旋酶

1．2．6谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC132032中的限制修饰系统

1．3谷氨酸棒杆菌的DNA转化方法及转化效率

1．3．1原生质体转化法和转导

1．3．2接合转移

1．3．3电转化

1．4严谨控制型表达载体及其在极毒蛋白表达中的应用

1．5主要研究内容和意义

2．1试验材料

2．1．1菌株、质粒和引物

2．1．2主要培养基及试剂

2．1．3主要试验仪器

2．2试验方法

2．2．1细菌基因组的制备

2．2．2质粒DNA的制备

2．2．3 PCR反应体系

2．2．4质粒和PCR产物的酶切、纯化和连接

2．2．5 E．coli化学转化法感受态细胞的制备和连接产物的转化

2．2．6谷氮酸棒杆菌电转化感受态细胞的制备和质粒的电转化

2．2．7 E．coli电转化感受态细胞的制备与基因的同源重组

2．2．8重组质粒的DNA测序

2．2．9蛋白质SDS-PAGE和Western Blot印迹分析

2．3菌种保藏

2．4．4 M．cglI基因的E．coli TG1染色体整合

2．4．5谷氨酸棒杆菌转化率的验证

2．5表达极毒蛋白的严谨控制型表达载体的构建

2．5．2验证pAU10表达载体的可用性

2．6．3 R．cglI蛋白的初步纯化

2．7 H．cglI蛋白在E coli中的表达及其可替代性验证

2．7．6构建重组质粒pET-28a-H．cglI

2．7．7 H．cglI蛋白的诱导表达

2．7．3 H．cglI蛋白的初步纯化

3结果与分析

3．1．2 M．cglI基因的甲基化功能验证

3．1．3重组质粒pAU4-Larm构建

3．1．4重组质粒pAU4-Larm-Rarm的构建

3．1．5重组质粒pAU4-Larm-cat-Rarm的构建

3．1．6重组质粒pAU4-Larm-M．cglI-cat-Rarm的构建

3．1．7基于同源重组的M．cglI基因的E．coli TG1染色体整合

3．1．8不同来源质粒DNA对谷氨酸棒杆菌转化率的影响

3．2表达极毒蛋白的严谨控制型表达载体的构建

3．2．1 pAU7载体的构建

3．2．2 pAU8载体的构建

3．2．3 pAU9载体的构建

3．2．4 pAU10表达载体的构建

3．2．5重组质粒pAU10-bamHI的构建

3．2．6 BamHI蛋白的表达

3．3．2 R．cglI蛋白在E．coli中的表达

3．3．3 R．cglI蛋白的粗分离

3．4．2重组质粒pACYC184-M．cglI和pAU4-R．cglI共转化实验

3．4．3重组质粒pET-28a-H．cglI构建

3．4．4 H．cglI蛋白的诱导表达

3．4．5 H．cglI蛋白的纯化

4讨论

5结论

参考文献

硕士期间发表文章

作者简历

致谢