基于FISH的芸薹属植物减数分裂染色体动态变化及白菜单低拷贝序列定位

摘要

减数分裂是有性植物生命周期中一个关键的过程。从酵母到植物，大量的研究表明多倍体经常影响减数分裂行为。芸薹属作为一个具有重要经济价值和研究多倍体进化模式的属，其不同物种的减数分裂研究主要集中在前期Ⅰ的终变期、中期和后期，关于减数分裂前间期和前期Ⅰ各个时期染色体的动态变化研究极少。荧光原位杂交(FISH)是一项重要的分子细胞遗传学工具，在揭示染色体行为、空间结构以及染色质重塑中发挥了重要作用。随着不同物种基因组测序的进展，以基于单低拷贝基因组或基因序列的长片段PCR产物为探针的FISH技术在验证基因组序列组装准确性、进行全基因组染色体核型分析以及跨物种比较研究方面表现出很大的优越性，然而该技术在芸薹属作物尚未获得应用。
　　基于此，本研究以芸薹属二、四倍体为材料，通过酶解制片法结合近着丝粒重复CentBr1、核仁组织区重复45S rDNA FISH分析和5-mC的荧光免疫检测，系统比较研究芸薹属二倍体和异源四倍体减数分裂过程中染色体和DNA甲基化的动态组织模式，同时以白菜为材料，利用在线软件查找白菜单低拷贝基因组或基因序列并设计PCR特异引物，以其扩增产物为探针，开展了在白菜中期染色体和粗线期染色体上的FISH研究。主要研究结果如下:
　　1、以芸薹属异源四倍体甘蓝型油菜、埃塞俄比亚芥及其二倍体亲本白菜、甘蓝、黑芥为研究对象，通过细胞学制片观察和Ⅰ-FISH技术，对花粉母细胞减数分裂前细胞间期核的形态、染色中心数目、空间排列形式进行了研究。结果表明:无论二倍体还是四倍体，细胞间期核均表现为有较深的染色中心;3个二倍体的染色中心数目变化幅度为6～32，四倍体的染色中心数目变化幅度为17～67;CentBr1和45S rDNA重复序列Ⅰ-FISH分析表明，除黑芥未检测到杂交信号外，CentBr1和45S rDNA在其他4个种的间期核内主要呈浓缩状态存在，分散分布于染色中心位置，平均信号数目均与其有丝分裂中期信号数目相近。
　　2、以45S rDNA和CentBr1为探针，利用FISH技术对芸薹属二、四倍体减数分裂过程中染色体的空间分布、联会构型和分离行为异同进行了观察分析。结果表明:无论二倍体还是四倍体，在细线期45S rDNA和CentBr1探针的FISH信号数目相较间期明显变少，主要分布于聚集的染色体团的异染色质块上，并随着异染色质的聚合分散处于动态变化之中，一直持续到偶线期和粗线期;双线期，随着同源染色体分离，45S rDNA和CentBr1的信号数逐渐增多，至终变期;中期Ⅰ和后期Ⅰ，染色质凝聚程度达到最大，常、异染色质无法区分，染色体数和2个探针的FISH信号数清晰可辨。与二倍体相比较，四倍体甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥前期Ⅰ早期总是在一个聚集的异染色质块上检出较多或较大的FISH信号杂交信号，后期随着不同的二价体从聚集的染色体团中分离，根据45S rDNA和CentBr1信号的分布模式，可以判断出甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥中的两套染色体组的分裂是分别保持独立的。
　　3、对二倍体和异源四倍体减数分裂前间期细胞和减数分裂染色体进行了5-mC冗余的免疫检测。结果表明:二倍体和四倍体的5-mC信号分布模式表现了高度的相似性。减数分裂前间期细胞5-mC信号主要分布在染色中心，从细线期到粗线期，强烈的5-mC信号在染色中心被检测到，并且延伸到常染色质，而没有配对的染色质区几乎没有甲基化的存在;双线期和终变期，5-mC信号主要表现在异染色质区和依然联会的染色体区段;中期Ⅰ和后期Ⅰ，由于染色体高度凝聚，5-mC信号在所有染色体上被检测，呈现出类似DAPI的染色，但在后期Ⅰ大部分细胞中有一极的部分染色体表现信号明显减弱。后期Ⅱ，细胞的4个极中有两极的染色体5-mC的信号强度亦明显较弱。
　　4、分别以大白菜A03染色体基因组DNA序列、油用白菜Yellow Sarson基因组测序获得的3条染色体4个片段序列、及大白菜不同染色体基因序列为对象，利用在线软件Repeatmasker查找无重复序列或区段，设计PCR长片段引物222对，预期片段长度变异在3～19kb，通过PCR扩增，共获得106个特异PCR产物，切胶回收纯化得到54个特异的序列产物，以其为探针分别在大白菜或Yellow Sarson中期或粗线期染色体上进行FISH，杂交结果显示:有39个探针在有丝分裂中期或粗线期染色体上检出了杂交信号，在中期染色体上检出的信号个数变异在4～20个，信号位置基本都位于近着丝粒区，在粗线期染色体上检出的信号个数变异在2～数个，信号位置也都位于异染色质区。
　　5、利用另一款重复序列查找软件Giri repbase对用于FISH的探针的模板序列进行分析，结果表明，无论Yellow Sarson供试的4段参考基因组序列，还是大多供试的白菜基因组或基因序列，都含有大量的转座子或反转录转座子等重复序列片段类型，极少有不含重复序列的片段大于4kb，即使含几个少量重复类型，大于6kb的片段也很少，推测其可能是产生重复杂交信号的主要原因，也为单低拷贝基因FISH探针的引物设计带来很大难度。
　　6、基于Giri repbase软件分析结果，重新对Yellow Sarson4段基因组参考序列和大白菜单、低拷贝基因序列不含或含1～3个重复的区段设计PCR引物53对，通过扩增、纯化回收，获得39个PCR特异产物，以其为探针在中期或粗线期染色体上进行FISH，其中仅有5个探针在中期或粗线期染色体上检测出了特异信号，还有20个探针在近着丝点区检测出了类似重复序列的杂交信号，其余14个探针没有检测到杂交信号。

目录

声明

摘要

1．1立题依据与研究目的意义

1．2国内外研究进展

1．2．1植物减数分裂染色体分离机制研究进展

1．2．2减数分裂染色体甲基化研究

1．2．3荧光原位杂交(FISH)技术的发展及应用

2．1试验材料

2．2试剂与仪器

2．2．1主要试验试剂

2．2．2主要试验仪器

2．2．3常用试剂配置

2．3试验方法

2．3．1染色体标本的制备

2．3．2减数分裂前间期核内染色中心数目的统计与分析

2．3．3基因组DNA的制备

2．3．5单低拷贝长片段PCR产物的制备

2．3．6探针的标记与检测

2．3．7原位杂交

2．3．8杂交后洗脱及信号检测

2．3．10杂交信号的捕获与图像处理

3 结果与分析

3．1芸薹属二、四倍体减数分裂前细胞问期核异染色质区组织模式

3．1．1芸薹属二、四倍体减数分裂前细胞间期核形态

3．1．2芸薹属二、四倍体减数分裂前细胞间期核内染色中心数分布情况

3．1．3 45S rDNA和CentBr1在二、四倍体有丝分裂中期染色体的FISH分析

3．1．4芸薹属二、四倍体减数分裂前细胞间期核的FISH分析

3．2芸薹属二、四倍体减数分裂过程中染色体动态组织模式研究

3．2．1 二倍体大白菜和甘蓝减数分裂染色体的FISH分析

3．2．2异源四倍体甘蓝型油菜和埃塞俄比亚芥减数分裂染色体的FISH分析

3．3芸薹属异源四倍体减数分裂过程中DNA甲基化分布模式研究

3．4白菜基于单低拷贝序列的PCR-FISH技术研究

3．4．1大白菜‘85-1’基因组序列基于Repeatmasker软件的PCR-FISH

3．4．2大白菜不同染色体单低拷贝基因基于Repeatmasker软件的PCR-FISH

3．4．3 Yellow Sarson基因组序列基于Repeatmasker软件的PCR-FISH

3．4．4白菜基因组序列和基因序列基于Giri repbase软件分析

3．4．5白菜基因组和基因序列基于Giri repbase软件分析的PCR-FISH

4 讨论

4．1染色中心与芸薹属物种倍性水平关系研究

4．3芸薹属物种减数分裂5-mC冗余信号的变化

4．4大白菜单低拷贝序列PCR产物FISH结果分析

5 结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢