产黄青霉苯乙酰CoA连接酶的研究和定点突变

摘要

青霉素属于β-内酰胺类抗生素，因其疗效好，抗菌活性强，对人体细胞毒性小且价格低廉而广泛应用，是目前治疗感染性疾病的重要药物。
　　 产黄青霉是一种丝状真菌，是青霉素的生产用菌，以α-氨基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸为原料的青霉素生物合成途径已有详细的阐述，通过菌种改良以获得更高产量是工业生产的重要课题。
　　 苯乙酰CoA连接酶(PCL)在青霉素合成途径中，催化苯乙酸与CoA反应生成苯乙酰CoA，苯乙酰CoA再在异青霉素N酰基转移酶(IAT)的催化下，与6-APA反应生成青霉素G。敲除了产黄青霉中编码PCL的基因(phl)，青霉素的合成量明显减少，因此，苯乙酰CoA连接酶是青霉素G生物合成途径中，增加苯乙酸侧链前体物质利用效率的重要酶之一。因此，克隆产黄青霉的苯乙酰CoA连接酶基因，并进行异源表达，可以为研究该酶的催化作用机制、酶的性质、对青霉素合成的影响以及代谢工程改造青霉素生产菌株奠定基础。
　　 本实验采用RT-PCR方法，从产黄青霉中克隆了苯乙酰CoA连接酶(phl)基因，构建了pET30a-phl表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了活性表达，经Ni-NTA亲和层析柱纯化了蛋白，研究了PCL的基本性质。
　　 本研究主要研究成果如下：
　　 1、本文克隆了产黄青霉中phl基因，构建了pET30a-phl表达质粒，并在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达。在16℃低温诱导下，SDS凝胶电泳出现一条分子量约为60 kDa的明显条带，与报道的苯乙酰CoA连接酶酶蛋白的理论分子量62.1 kDa一致。重组质粒pET30a-phl在BL21(DE3)中表达的酶活达到1680 U/mL。
　　 2、本文克隆的产黄青霉中phl基因所编码的苯乙酰CoA连接酶，通过序列分析以及结构预测，其氨基酸序列与NCBI数据库中多个产黄青霉的苯乙酰CoA连接酶(登录号分别为：XM_002565364.1，AJ001540.1，NW_003020081.1，AM920437.1，.AM048877.1)100％同源，与Aspergillus fumigatus Af293(XP_753893.2)、Neosartoryafischeri NRRL181(XP_001259941.1)、Aspergiilus oryzae RIB40(XP_001823173.1)Aspergillus flavus NRRL3357(XP_002378509.1)、Aspergillus clavatus NRRL1(XP_001274067.1)、Aspergillus terreus NIH12624(XP_001216727.1)达到70％以上同源。
　　 3、纯化酶PCL的基本性质：最适温度是30℃；有一定的热稳定性；最适pH为8.0；pH7.0-8.5酶比较稳定。
　　 4、采用重叠延伸PCR法(Over-lap extension PCR，OE-PCR)，实现PCL定点突变，获得G337S突变子、G337D突变子、G337K突变子、G337F突变子、G337H突变子、A338S突变子、A338D突变子、A338K突变子、A338F突变子和A338H突变子，用于研究酶的底物特异性。
　　 产黄青霉phl的克隆及其在大肠杆菌中的表达，为进一步研究该酶的结构，通过定向进化，提高酶的催化活性或改变酶的底物特异性，为青霉素生产菌的遗传改造及其组合生物合成学的研究奠定了基础。