粘红酵母苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的制备

摘要

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是催化合成L-苯丙氨酸的关键酶,但在转化过程中,PAL活力低,不稳定限制了其使用。为了提高该酶的活性和稳定性,本文分别优化了粘红酵母苯丙氨酸解氨酶合成条件,制备了交联酶聚体(PAL-CLEAs)并对其酶学性质进行了研究。
　　 1)粘红酵母苯丙氨酸解氨酶合成条件的优化。
　　 首先采用单因子优化了碳源、氮源、无机盐,之后利用Plackett-Burman设计和最陡爬坡实验设计优化各因素水平到最佳产酶区域,以及确定最适诱导物,并优化了发酵罐培养的初始糖浓度、产酶pH和诱导物添加时间。确定的最佳合成条件:培养基(g/L):葡萄糖1、氯化钠5、蛋白胨35、磷酸二氢钾0.25、磷酸氢二铵1.5:培养条件:接种量5%、初始pH5、控制产酶pH7;最佳诱导物是L-苯丙氨酸,诱导时间8h和26h;最高酶活达40.85U/g,比优化前提高7.3倍。
　　 2)苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体制备。
　　 分别考察了菌体收集时机、沉淀剂及浓度、交联剂浓度、交联时间和酶活保护剂对PAL-CLEAs活性的影响。结果表明,牛血清白蛋白的添加对PAL-CLEAs活性无影响,获得的最佳条件为:利用收集的发酵培养25h的菌体提取粗酶液,之后用饱和度40%的硫酸铵沉淀,最后加入终浓度0.1%的戊二醛交联2h,酶活回收率达到27%。
　　 3)PAL-CLEAs酶学性质研究。
　　 分别考察了最适反应温度、最适反应pH、室温贮存稳定性、酸碱处理稳定性、抗变性剂稳定性及重复使用性。结果表明,PAL-CLEAs的最适反应温度和pH分别为50℃和8;在室温下贮存时,PAL-CLEAs储存稳定性明显比粗酶的时间长,其中,PAL-CLEAs在25℃时保存14d仍具有较高活性,但游离酶基本已经失活;PAL-CLEAs对酸碱的耐受性略优于游离酶,在pH8-10下处理时,PAL-CLEAs的相对酶活比游离酶高6.67%;PAL-CLEAs对变性剂的耐受性也明显高于粗酶,当用尿素和乙醇作为变性剂时,PAL-CLEAs的相对酶活比游离酶高出10%;而且,PAL-CLEAs的操作稳定性也较好,在分批转化反应中,PAL-CLEAs连续反应7批次后还能保持一半的酶活。