苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体的修饰及稳定性研究

摘要

交联酶聚体技术(CLEAs)是一种新兴的无载体酶固定化技术，具有制备简单、操作稳定性强、储存时间长、易于回收和重复利用及在水相介质中稳定不易泄露等优点，已经被应用在多种酶的固定化。我们利用该技术制备的苯丙氨酸解氨酶交联酶聚体(PAL-CLEAs)虽然具有易回收、储存稳定性好、重复利用率高等优点，可在制备过程中发现， PAL-CLEAs具有酶活回收率低，对温度和有机溶剂耐受性较差等缺陷。因此，本文分别研究了糖类、淀粉和牛血清白蛋白(BSA)对PAL-CLEAs制备过程中的修饰作用，以期提高PAL-CLEAs的酶活回收率及其催化性能。
　　 1)糖类对PAL-CLEAs的修饰及其稳定性研究
　　 通过单因素实验，考察了不同的糖对交联酶聚体酶活回收率及稳定性的影响。确定了添加糖的种类和浓度:当蔗糖的添加量为15 g/L时，得到的蔗糖-PAL-CLEAs的酶活比不添加时提高了16％。稳定性研究表明:在50℃时，蔗糖-PAL-CLEAs和PAL-CLEAs在13.5 h后的酶活保留率分别为50％和40％，说明蔗糖能够在一定程度上提高PAL的温度稳定性;在碱性条件下(pH8-10)处理3h后，蔗糖-PAL-CLEAs的稳定性比PAL-CLEAs强，前者比后者的酶活保留率高出7％;同时也发现，蔗糖不能保护交联酶聚体不受有机溶剂的损害;其储存稳定性略优于PAL-CLEAs，储存25天后，蔗糖-PAL-CLEAs的酶活保留率比PAL-CLEAs高4％;在分批转化反应中，表现出了良好的操作稳定性，连续转化7个批次后，蔗糖-PAL-CLEAs比PAL-CLEAs的酶活保留率高出6％。
　　 2)粘红酵母(Rhodotorula glutinis CICC32913)苯丙氨酸解氨酶(PAL)的部分纯化
　　 利用涡流法对粘红酵母(Rhodotorula glutinis)细胞进行破壁，对粗酶液采用40％饱和度的硫酸铵进行沉淀，透析12h除硫酸铵。收集的酶液经PEG20000浓缩后，通过Sepharose4B凝胶柱、DEAE-Sepharose FF离子交换柱进行了部分纯化。纯化倍数为15.36，酶活回收率为27.15％。部分纯化后的酶液经SDS凝胶电泳得到五个条带，表明得到部分纯化的PAL。
　　 3)牛血清白蛋白(BSA)、淀粉对交联酶聚体的修饰及稳定性研究
　　 利用部分纯化的酶制备了PAL-CLEAs，优化了制备条件，并考察了BSA和淀粉对PAL-CLEAs酶活的影响。确定了制备PAL-CLEAs的优化条件是:硫酸铵饱和度60％;10％戊二醛加入量10μL;交联时间2h。BSA-PALCLEAs的最佳制备条件是:BSA的添加量为5 mg/mL;硫酸铵饱和度为80％;10％戊二醛加入量为10μL;交联时间为2h。制备淀粉-PALCLEAs时淀粉加入的最适量是5 mg/mL。制备淀粉-BSA-PALCLEAs时淀粉和BSA加入的最适量均为5 mg/mL。
　　 研究了游离酶、PAL-CLEAs、淀粉-PALCLEAs、BSA-PALCLEAs、淀粉-BSA-PALCLEAs的对温度、pH、有机溶剂耐受性，储存稳定性及重复利用性。结果表明:淀粉和BSA的添加均能够提高PAL-CLEAs对温度的耐受性，在40℃处理12 h后，BSA-PALCLEAs的酶活保留率比PAL-CLEAs提高了26％;在不同的pH条件下，几种不同形态的PAL的稳定性没有明显差距;在有机溶液中，只有加入淀粉的交联酶聚体稳定性有了显著的提高，当甲醇和异丙醇的浓度为30％时，淀粉-PALCLEAs的酶活保留率分别比PAL-CLEAs高6％和35％;在4℃和25℃储存时，加入淀粉和BSA后的交联酶聚体，储存稳定性都有了不同程度的提高;连续进行反式肉桂酸转化实验8个批次后，淀粉-PALCLEAs的酶活保留率比不加修饰剂时高出14％，而加入BSA后反而使交联酶聚体的稳定性明显下降。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 研究背景

1．2 苯丙氨酸解氨酶研究进展

1．2．1 苯丙氨酸解氨酶的分布

1．2．2 苯丙氨酸解氨酶的分离纯化

1．2．3 苯丙氨酸解氨酶稳定性研究

1．3 交联酶聚体技术的研究进展

1．3．1 交联酶聚体技术制备条件的优化

1．3．2 交联酶聚体技术的优缺点

1．3．3 添加辅助剂制备交联酶聚体

1．3．4 多孔交联酶聚体的制备

1．3．5 印记交联酶聚体的制备

1．3．6 共价连接交联酶聚体的制备

1．3．7 包埋交联酶聚体的制备

1．3．8 新型交联酶聚体的制备

1．4 CLEAs技术在不同酶中的应用

1．4．1 酰胺酶交联酶聚体

1．4．2 蛋白酶交联酶聚体

1．4．3 脂肪酶交联酶聚体

1．4．4 酯酶交联酶聚体

1．4．5 裂合酶类交联酶聚体

1．5 立题的目的和意义

1．6 研究内容

第2章 糖类对PAL-CLEAs的修饰及稳定性研究

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 菌种

2．2．2 试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 培养基

2．3．2 酶活测定方法

2．3．3 粗酶的提取

2．3．4 糖类对PAL-CLEAs活性的影响

2．3．5 游离酶、PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs的温度稳定性

2．3．6 游离酶、PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs的酸碱处理稳定性

2．3．7 游离酶、PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs对有机溶剂的耐受性

2．3．8 游离酶、PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs的储存稳定性

2．3．9 PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs重复利用性

2．4 结果与分析

2．4．1 糖类对PAL-CLEAs活性的影响

2．4．2 游离酶、PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs的温度稳定性

2．4．3 游离酶、PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs的酸碱处理稳定性

2．4．4 游离酶、PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs在有机溶剂中的稳定性

2．4．5 游离酶、PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs储藏稳定性

2．4．6 PAL-CLEAs、蔗糖-PAL-CLEAs的重复利用性

2．5 本章小结

第3章 粘红酵母苯丙氨酸解氨酶的部分纯化

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 菌种

3．2．2 主要实验试剂及耗材

3．2．3 实验仪器

3．3 实验方法

3．3．1 酶活测定方法

3．3．2 蛋白质含量测定方法—考马斯亮蓝法测蛋白质浓度

3．3．3 粘红酵母菌体的培养及分离

3．3．4 粗酶液的提取

3．3．5 苯丙氨酸解氨酶的部分纯化

3．3．6 聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．4 结果分析

3．4．1 硫酸铵分级沉淀曲线

3．4．2 Sepharose 4B凝胶过滤层析

3．4．3 DEAE-Sepharose FF离子交换层析

3．4．4 苯丙氨酸解氨酶纯化步骤及纯化效率

3．4．5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

3．5 本章小结

第4章 淀粉、BSA对PAL-CLEAs的修饰作用的研究

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 菌体

4．2．2 试剂

4．2．3 仪器

4．3 方法

4．3．1 部分纯化的PAL的制备

4．3．2 PAL-CLEAs的制备

4．3．3 BSA-PALCLEAs的制备

4．3．4 淀粉-PALCLEAs的制备

4．3．5 淀粉-BSA-PALCLEAs的制备

4．3．6 温度稳定性

4．3．7 pH稳定性

4．3．8 有机溶剂稳定性

4．3．9 储藏稳定性

4．3．10 重复利用稳定性

4．4 结果与讨论

4．4．1 PAL-CLEAs的制备

4．4．2 BSA-PALCLEAs的制备

4．4．3 淀粉-PALCLEAs的制备

4．4．4 淀粉-BSA-PALCLEAs的制备

4．4．5 温度稳定性

4．4．6 pH稳定性

4．4．7 有机溶剂稳定性

4．4．8 储藏稳定性

4．4．9 重复利用稳定性

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间所发表的论文

致谢