SD大鼠脑动脉内皮细胞培养

摘要

血管新生是从即有血管的内皮细胞增殖或游走到其他地方从新形成子代血管分支的过程。脑动脉新生可以重建有效血供，从而改善多发性、弥漫性脑动脉粥样硬化（Cerebral atherosclerosis，CAS）所致的脑缺血，最终预防痴呆和脑梗死发生。近年来许多的与血管新生有关的基因功能和信号转导机制在胚胎脑血管发生的研究成果，为脑血管新生的研究已经奠定下了理论基础[1]。Yoshimura S将带有肝细胞生长因子的HVJ(野生型病毒)–liposome的复合基因载体注射到大鼠的蛛网膜下腔，可以见到大脑脑表面的新生血管增多，大脑的灌注量也增加明显，从而显示了肝细胞生长因子促进大脑血管生成的作用[2]。近几年来关于动脉新生机制的研究成果不断取得进展[3,4,5,6]。在中文、外文数据库均没有找到SD大鼠CAEC的体外培养方法，给相关实验研究带来一定的困难。虽然SD大鼠脑微血管的内皮细胞(BMECs)的培养方法成熟，但脑动脉内皮细胞(Cerebral Artery Endothelial Cell,CAEC)不同于大脑微血管的内皮细胞(BMECs)，脑动脉内皮细胞不参与构成血脑屏障,两种细胞表现不同的功能异质性[7]。SD大鼠脑动脉内皮细胞的培养为体外研究脑动脉新生机制研究提供基础。DF大鼠脑动脉内皮细胞的体外培养难度较大,我们经过过对国内、外细胞培养方法进行分析和反复试验，总结出了能够培养纯化度较高的SD大鼠脑动脉内皮细胞的培养方法。 目的：探讨获取纯度较高的体外原代SD大鼠脑动脉内皮细胞(Cerebral Artery Endothelial Cell，CAEC)的培养方法并鉴定，并测定SD大鼠脑动脉内皮细胞的增值和迁移能力。 方法：选取5~6周SD雄性大鼠6只，体重110-140g，无菌条件下取鼠脑、脑动脉，采用剪碎、组织块原代培养大鼠脑动脉内皮细胞的方法，接种于明胶包被的直径35mm培养皿中，应用内皮细胞专用培养基进行培养；经过消化传代，用第3代细胞，在倒置相差显微镜下进行细胞形态的观察，在普通光学显微镜下对细胞第Ⅷ因子免疫细胞化学染色进行观察，在荧光显微镜下对细胞第Ⅷ因子免疫荧光染色进行观察，从这三个方面对细胞进行鉴定。应用MTT检测法测定SD大鼠脑动脉内皮细胞的增殖能力，应用细胞划痕实验检测大鼠脑动脉内皮细胞的迁移能力。 结果：培养60h后可见细胞从贴壁的血管片段周围长出，细胞呈梭形；培养7d细胞可融合成片；融合后的脑动脉细胞呈典型的“鹅卵石”样外观；免疫荧光法检测显示动脉内皮标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性，内皮细胞纯度90％以上。 1．培养60h后于倒置相差显微镜下观察，可见细胞从贴壁的血管片段周围长出（图1-C），细胞呈梭形；培养7d细胞可融合成片（图1-E）；融合后的脑动脉内皮细胞呈现出内皮细胞典型的“铺路石”样外观；细胞之间的大小和形状都较为均匀一致，原代培养9d细胞的融合度达到80%以上（图1-F）。1：3传代后24h可见培养皿散在梭型细胞贴壁，传代后6d长满可继续传代，传6代细胞增值能力及形态无改变。 2．免疫细胞化学染色和免疫荧光鉴定：细胞第Ⅷ因子相关抗原呈阳性，胞浆着色呈棕褐色，PBS代替一抗加入设置阴性对照，染色呈阴性（图4）；细胞第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色，胞浆呈现绿色，胞核被染为蓝色,PBS代替一抗加入设置阴性对照，染色呈阴性（图2）。内皮细胞纯度90％以上。 3.MTT法检测细胞增殖情况，第4-8天生长速度较快，9-12天生长速度明显减慢（见图5）。划痕实验，培养48h后，细胞受损边缘带见少数散在的迁移出来的脑动脉内皮细胞(见图6)。 结论：选取5~6周SD雄性大鼠6只，体重110-140g，采用组织块培养法，应用内皮细胞培养基培养可以成功获得纯度90%的大鼠脑动脉内皮细胞。

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