TGFβ1诱导的MCF-7乳腺癌细胞ARA55表达可促进细胞的生长及侵袭转移

摘要

目的：
　　乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率最高的类型，而转移是导致乳腺癌患者不良预后的主要因素。雄激素受体相关蛋白55（androgen receptor coactivator55kDa protein，ARA55），是LIM蛋白家族成员之一。研究表明，乳腺癌的复发转移与癌细胞的上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transitions，EMT)特征密切相关。研究证实，ARA55主要存在于细胞的黏着斑和细胞核中，并往返穿梭于胞质和胞核之间，参与TGFβ1诱导的细胞粘附、EMT以及细胞的生长、迁移等重要生理过程。目前，ARA55在乳腺癌生长及侵袭迁移中的作用并不明确。本课题旨在研究TGFβ1诱导的ARA55表达在乳腺癌细胞生长、侵袭转移等生物学特性中发挥的作用。通过上述研究以明确TGFβ1介导的ARA55表达在乳腺癌细胞侵袭、转移等过程中的功能，为进一步完善乳腺癌的侵袭转移机制理论提供新的实验和理论依据。
　　方法：
　　1.利用10ng/ml浓度的TGFβ1诱导MCF-7等细胞株中ARA55的表达，通过RT-PCR和免疫印迹验证ARA55的表达;通过CCK-8比色实验、划痕修复、Transwell小室侵袭迁移等实验，研究TGFβ1诱导的ARA55表达上调在MCF-7乳腺癌细胞生长、侵袭迁移等过程中发挥的作用。免疫印迹检测ARA55蛋白及EMT相关蛋白Claudin-1、N-cadherin等的表达变化。
　　2.采用siRNA-ARA55质粒，转染至MCF-7细胞下调ARA55表达(siRNA-negative作为空载体对照);RT-PCR、免疫印迹检测ARA55表达的干扰效果。通过CCK-8比色实验、划痕修复、小室侵袭迁移等实验，反向验证诱导后的ARA55表达沉默对MCF-7等乳腺癌细胞生长、侵袭迁移等生物学特性的影响。
　　结果：
　　1.RT-PCR和免疫印迹结果显示，不同浓度的TGFβ1(5、10ng/ml)诱导12h后，ARA55mRNA和蛋白的表达升高，并呈现一定的浓度依赖趋势;采用10ng/ml的TGFβ1分别诱导12h、24h、48h后，免疫印迹结果显示诱导24h和48hARA55蛋白的表达水平相当，ARA55蛋白的表达水平可在24h达到高峰。
　　2.转染siRNA-ARA55干扰质粒后，RT-PCR和蛋白免疫印迹实验结果显示，TGFβ1+siRNA-ARA55组的ARA55mRNA和蛋白的表达水平低于TGFβ1诱导组，说明诱导表达的ARA55可以被siRNA-ARA55沉默表达。
　　3.加入TGFβ1诱导24h后，0、5、10ng/ml浓度组的吸光度(OD)值分别为0.427±0.025，0.677±0.053，0.743±0.026;诱导48h后，OD值别为0.643±0.041，0.827±0.036，0.933±0.012，组间OD值比较差异均具有统计学意义（P均＜0.05）;诱导72h后，OD值分别为0.676±0.038，0.927±0.058，1.183±0.050，组间OD值比较差异具有统计学意义（P均＜0.05）。
　　4.TGFβ1浓度组(10ng/ml)与TGFβ1+siRNA-negative组的生长趋势基本一致，其24h、48h和72h的OD值分别为（0.743±0.059vs.0.773±0.012）、（0.917±0.01vs.0.907±0.039）和（1.153±0.082vs.1.2±0.131）;而TGFβ1+siRNA-ARA55组和空白对照组24h、48h和72h的OD值分别为(0.43±0.045vs.0.5033±0.033)，(0.603±0.032vs.0.723±0.025)和（0.673±0.038vs.0.813±0.057）。TGFβ1浓度组(10ng/ml)与空白对照组相比，24h、48h和72h的OD值均具有统计学差异(P＜0.05)。TGFβ1+siRNA-ARA55组和TGFβ1+siRNA-negative组相比，24h、48h和72h的OD值均具有统计学差异(P＜0.05)。
　　5.划痕修复实验显示，TGFβ1浓度组(10ng/ml)与TGFβ1+siRNA-negative组的迁移细胞数基本一致，其48h发生迁移的细胞数（每个视野）为(242.33±6.94vs.223±8.04)，而TGFβ1+siRNA-ARA55组和空白对照组48h发生迁移的细胞数（每个视野）为（118.67±7.86vs.50.67±4.64）。TGFβ1浓度组(10ng/ml)与空白对照组相比，48h发生迁移的细胞数量具有统计学差异（P＜0.05）。TGFβ1+siRNA-ARA55组和TGFβ1+siRNA-negative组相比，48h发生迁移的细胞数量具有统计学差异(P＜0.05)。
　　6.Transwell小室实验结果显示，TGFβ1浓度组(10ng/ml)与TGFβ1+siRNA-negative组48h发生侵袭迁移的细胞数（每个视野）为(78.667±2.055vs.80.67±2.49);TGFβ1+siRNA-ARA55组和空白对照组48h发生侵袭迁移的细胞数（每个视野）为（37.33±2.055vs.27.34±3.40）。TGFβ1浓度组(10ng/ml)与空白对照组相比，48h发生迁移的细胞数量具有统计学差异(P＜0.05)，同时，TGFβ1+siRNA-ARA55组和TGFβ1+siRNA-negative组相比，48h发生侵袭迁移的细胞数量具有统计学差异(P＜0.05)。
　　7.免疫印迹结果显示，TGFβ1浓度组(10ng/ml)与TGFβ1+siRNA-ARA55组相比，N-Cadherin蛋白的表达升高(P＜0.05)，而Claudin-1蛋白的表达降低(P＜0.05)。
　　结论：
　　TGFβ1可通过诱导MCF-7乳腺癌细胞中ARA55的表达来促进细胞的生长和侵袭迁移过程。

目录

声明

摘要

前言

1 材料与方法

1．2 主要试剂／试剂盒

1．3 主要实验用仪器和设备

1．4 主要试剂的配置

1．5 实验方法和步骤

2 实验结果

2．3 RT-PCR和免疫印迹检测转染siRNA-ARA55前后ARA55的表达水平改变

2．4 TGFβ1诱导ARA55表达对MCF-7乳腺癌细胞生长增殖的影响

2．6 划痕修复实验检测TGFβ1诱导的ARA55表达对MCF-7细胞迁移能力的影响

2．7 Transwell小室实验检测TGFβ1诱导ARA55表达对MCF-7细胞侵袭迁移能力的影响

2．8 蛋白免疫印迹检测ARA55诱导表达及沉默后EMT相关蛋白的表达改变

3 讨论

4 结论

参考文献

综述

附录

致谢

个人简历