蜡状芽孢杆菌Bc-05菌株发酵优化、纤溶酶分离及酶学性质研究

摘要

血栓性疾病严重危害着人类尤其是中老年人身体健康，近年来已成为常见病和多发病，是造成死亡和病残的首要原因。溶栓疗法是血栓性疾病安全且有效的治疗手段。溶栓药物又称为纤溶酶（Fibrinolytic Enzyme，FE），可分为直接降解血栓中纤维蛋白（原）的纤溶酶和将纤溶酶原激活为纤溶酶的纤溶酶原激活剂。天然的纤溶酶可来源于动物、植物和微生物等。其中微生物是纤溶酶的重要来源，安全性好，价格便宜，具有开发成新一代溶栓药和相关功能食品的潜力。从中国传统发酵食品豆豉中分离到多种具有较高纤溶活性的菌株，由这些菌株所产的蛋白酶命名为豆豉纤溶酶，它是一种高效的可直接溶解纤维蛋白的丝氨酸蛋白酶，不但可直接水解血液纤维蛋白凝固形成的血栓成小肽及氨基酸，抑制血栓形成，而且有溶栓效果好，无毒副作用，不引起内出血，半衰期长等功能。因此，开发豆豉纤溶酶制剂具有极为诱人的广阔前景。
　　 本文从各地的豆豉中采用纤维蛋白平板法分离到77株产纤溶酶的菌株，并从中筛选出一株具有较高纤溶活性的菌株，定名为Bc-05菌株。本文针对该菌株进行下列研究：菌种鉴定、液体发酵条件优化、豆豉纤溶酶的提取、分离和纯化，酶学性质研究，通过上述研究，得到以下主要研究结果：
　　 通过形态观察、生理生化试验表明菌株Bc-05与芽孢杆菌属（Bacillus spp.）的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的特征比较接近，16S rDNA序列系统发育树同源性分析两者的同源性达到97.25％，因而确定Bc-05菌株为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）；通过各单因素实验和正交实验分析，对蜡状芽孢杆菌Bc-05（Bacillus cereus）菌株进行发酵条件优化，优化后发酵培养基组成为：葡萄糖10.0 g/L、大豆蛋白胨10.0 g/L、Na2HPO4·12H2O4.0 g/L、NaH2PO4·2H2O2.0 g/L、MgSO4-7H2O0.1 g/L、CaCl2·2H2O0.2g/L；250mL摇瓶发酵的最佳工艺条件是：培养基灭菌前pH7.0，接种量4％，装液量50mL，发酵温度30℃，旋转摇床转速150rpm，发酵周期48h，此条件下产酶量最高可达620.34±14.55U/mL，比优化前的336.29±8.72U/mL提高了84.47％；通过硫酸铵盐分级沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析对该菌株的发酵上清液进行分离纯化，得到一个电泳纯酶，用纤维蛋白平板法测定该酶比活力为6963.40U/mg，SDS-PAGE测定相对分子量为36.0KDa，从发酵上清液到该酶纯化倍数达到39.18倍，纯活性回收率25.31％。将SDS-PAGE电泳所得单一条带转PVDF膜后测序得到N端氨基酸序列测定为NH2-Val-Thr-Pro-Thr-Asn-Ala-Val-Asn-Thr-Gly，与其他生物来源的纤溶酶序列不同。
　　 对其纤溶性质研究表明：经纤维蛋白平板检测有直接水解纤维蛋白和激活纤溶酶原的双重作用，该酶最适作用温度37℃，最适pH8.0，在pH8.0条件下25℃和37℃放置24小时酶活力仍保持81.58％和88.93％，该酶体外对兔血凝块有明显的溶解作用；Ca2+、Mn2+离子对该酶具有激活作用，而Cu2+、Fe3+完全抑制其纤溶活性，EDTA、PMSF和DTT对该酶有抑制作用，说明活性中心含有二硫键、金属和丝氨酸，属于丝氨酸蛋白酶类。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第1章 文献综述

1.1血栓性病

1.2血栓的形成与溶解机制

1.3血栓疾病的治疗方法

1.4溶栓药物的应用和研究进展

1.4.1链激酶(Streptokinase，SK)

1.4.2尿激酶(Urokinase，UK)

1.4.3组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,t-PA)

1.4.4茴香酰化纤溶酶原-链激酶激活剂复合物(anisoylated plasminogen streptokinase activator complex，APSAC)

1.4.5单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(single chain urokinase plasminogen activitor,scu-PA)

1.4.6吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Bat-PA，DSPAal)

1.4.7葡激酶(staphyrlokinase，SaK)

1.4.8蛇毒溶栓酶(snake venom fibrinoenase)

1.4.9瑞替普酶(reteplase，r-PA)

1.4.10兰替普酶(1anoteplase，NPA)

1.4.11替尼普酶(tenecteplase，TNK-t-PA)

1.4.12孟替普酶(monteplase)

1.4.13 K1K2Pu嵌合体

1.4.14抗纤维蛋白单克隆抗体与t-PA的结合体

1.5国内外微生物产纤溶酶的研究现状

1.5.1 β-溶血链球菌(Streptococcus homolyticus)

1.5.2金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

1.5.3纳豆杆菌(Bacillus natto)

1.5.4枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

1.5.5解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

1.5.6蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)

1.5.7曲霉(Aspergillus sydowij)

1.5.10根霉(Rhizopus Chinensis)

1.5.11里氏木霉(Trichoderma reesei)

1.5.12链霉菌(Streptonyces sp.)

1.5.13海洋假单胞菌(Pseudomonas Maine)

1.5.14脉胞霉(Neurospora sp.)

1.6立题意义

1.7研究内容

1.7.1出发菌的筛选

1.7.2 Bc-05的发酵条件优化

1.7.3酶的纯化及其酶学性质的初步研究

第2章 产纤溶酶菌株的筛选与鉴定

2.1材料

2.1.1试验材料

2.1.2主要试剂

2.1.3缓冲液

2.1.4主要仪器设备

2.1.5培养基

2.2试验方法

2.2.1菌株的分离筛选

2.2.2纤溶酶活性测定

2.2.3产纤溶酶菌株的筛选

2.2.4 Bc-05菌株形态及生理生化特征鉴定

2.2.5 16S rDNA序列测定

2.2.6 16S rDNA序列分析及系统发育树绘制

2.3结果与分析

2.3.1产纤溶酶活性菌株的筛选

2.3.2 Bc-05菌株菌落形态

2.3.3 Bc-05菌株菌体形态

2.3.4 Bc-05菌株生理生化特性

2.3.5 Bc-05菌株的16S rDNA测序结果

2.4讨论

第3章 蜡状芽孢杆菌Bc-05菌株产纤溶酶的发酵条件优化

3.1材料

3.1.1试验菌株

3.1.2试验试剂

3.1.3培养基

3.2试验方法

3.2.1氮源对Bc-05菌株产酶的影响

3.2.2碳源对Bc-05菌株产酶的影响

3.2.3无机离子对Bc-05菌株产酶的影响

3.2.4正交试验优选培养基成分配比

3.2.5培养条件对Bc-05菌株产酶的影响

3.2.6 Be-05菌株产酶曲线的确定

3.2.7纤溶酶活力测定

3.3结果与分析

3.3.1尿激酶活力标准曲线

3.3.2发酵培养基主要成分对Bc-05菌株产酶的影响

3.3.3发酵培养基主要成分的正交试验

3.3.4发酵工艺条件对Bc-05菌株产纤溶酶的影响

3.3.5 Bc-05菌株产酶曲线的确定

3.4讨论

第4章 蜡状芽孢杆菌Bc-05菌株纤溶酶的分离纯化

4.1材料

4.1.1试验菌株

4.1.2培养基

4.1.3主要试剂和缓冲液

4.1.4主要仪器设备

4.2方法

4.2.1纤溶酶活力测定

4.2.2蛋白质浓度的测定

4.2.3硫酸铵分级沉淀和纤溶酶的提取

4.2.4 DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析

4.2.5酶的纯度和分子量测定

4.2.6 Fibrin-PAGE电泳

4.2.7转膜与测序

4.3结果

4.3.1尿激酶活力标准曲线

4.3.2蛋白质浓度曲线

4.3.3 B.cereus Bc-05菌株发酵液硫酸铵分级沉淀

4.3.4 B.cereus Bc-05纤溶酶的DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析

4.3.5分离组分的SDS-PAGE电泳纯度鉴定

4.3.6分离组分的Fibrin-PAGE电泳

4.3.7转膜与测序结果

4.3.8纯化方案的评价

4.4讨论

第5章 蜡状芽孢杆菌Bc-05菌株纤溶酶的酶学性质研究

5.1材料

5.1.1试验材料

5.1.2试剂

5.2试验方法

5.2.1纤溶酶活力测定

5.2.2对纤溶酶原激活作用的测定

5.2.3最适温度及温度稳定性测定

5.2.4最适pH及pH稳定性测定

5.2.5抑制剂对Bc-05-1纤溶酶活性的影响

5.2.6金属离子对Bc-05-1纤溶酶活性的影响

5.2.7蛋白变性剂对Bc-05-1纤溶酶活性的影响

5.2.8蛋白酶对Bc-05-1纤溶酶活性的影响

5.2.9 Bc-05-1纤溶酶体外血凝块的溶解作用

5.3结果与分析

5.3.1尿激酶活力标准曲线

5.3.2纤维蛋白溶酶原(plasminogen)激活活性测定

5.3.3最适温度及温度稳定性测定

5.3.4最适pH及pH稳定性

5.3.5抑制剂对Bc-05-1纤溶酶活性的影响

5.3.6金属离子对Bc-05-1纤溶酶活性的影响

5.3.7变性剂对Bc-05-1纤溶酶活性的影响

5.3.8蛋白酶对Bc-05-1纤溶酶活性的影响

5.3.9 Bc-05-1纤溶酶体外血凝块的溶解作用

5.4讨论

第6章 结论与创新点

附录

参考文献

在读期间发表的学术论文

致谢