红曲霉生淀粉酶发酵优化、分离纯化及其酶学性质研究

摘要

生淀粉酶是指能对不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒能够表现出强水解活性的酶类。由于生淀粉酶能将未经蒸煮糊化的生淀粉直接转化成葡萄糖等可发酵性糖供微生物生长与代谢，其比传统的高温蒸煮糖化节约25％-30％的能耗。正是由于生淀粉酶具有的潜在的工业应用价值和某些特殊用途，因此一直受到国内外许多研究人员的关注。
　　本课题从生淀粉酶产生菌Monascus M2为出发菌株，通过发酵条件和培养基优化，使菌株的产酶能力进一步提高，对所产的粗酶液进行了分离纯化，并对纯化后酶液的部分酶学性质进行了研究。其主要研究结果如下:
　　(1)对红曲霉M2产生淀粉酶的固态发酵进行了优化。对固态发酵条件优化结果表明:温度为32℃，pH值5.0，无机盐水量为14mL，培养时间8d时，在该条件下可得到红曲霉M2产生淀粉酶的最大酶活:445.37U/g。培养基优化单因素结果表明:最适碳源为乳糖，氮源为(NH4)2SO4，最适无机盐为K2HPO4，进一步通过Box-Bohnken中心组成实验设计和响应面分析，最终确定适宜的培养基条件为:乳糖添加量为1.80g、(NH4)2SO4添加量为1.40g、 K2HPO4添加量为0.2g。预测值为680.29 U/g,在以上优化的培养条件下，对实验结果进行验证，得到生淀粉酶酶活为662.21 U/g。
　　(2)红曲霉M2固态发酵成熟曲经水浸提、硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析等提纯步骤，获得了比酶活396.61U/mg蛋白的生淀粉酶、纯化倍数为6.86、回收率为12.70％。其Tricine-SDS-PAGE呈单一条带。用Tricine-SDS-PAGE测得生淀粉酶的相对分子质量约为67.81kD。
　　(3)对纯化后的红曲霉生淀粉酶进行了酶学性质研究，试验结果表明:最适作用温度为50℃，60℃保温2h仍可以保持近70％的酶活力，最适作用pH为5.0，在pH3.0-7.0的环境条件下保温30min仍可以保持60％以上的酶活力。以生玉米淀粉为底物的酶动力学常数Km和Vmax值分别为14.96mg·ml-1和10.79mg·mL-1·min-1; Mn2+、Ca2+、Ba2+对酶有激活作用，而Na+、K+、Mg2+、Zn2+对酶基本无影响，Fe3+对酶有强烈的抑制作用。L-半胱氨酸对该酶有促进作用，SDS、DMSO、DTT和β-巯基乙醇对酶活基本无影响，EDTA和EGTA能较弱抑制该酶的酶活力，而PMSF、KMnO4、氯胺T和Triton X-100则能强烈抑制生淀粉酶的酶活。
　　综上所述，本研究通过固态发酵提高了Monascus M2产生淀粉酶的能力，其所产生的生淀粉酶在实验条件下不仅具有极强的pH稳定性，而且还能适应较宽的pH范围。与此同时大多数金属离子和化学物质对该酶的影响不大，因此具有较高的理论和实用价值。

目录

声明

摘要

缩略词

1 文献综述

1．1 生淀粉酶的概述

1．1．1 生淀粉酶与淀粉酶

1．1．2 生淀粉酶的作用机理

1．1．3 产生淀粉酶的主要微生物

1．1．4 生淀粉酶的应用

1．2 红曲霉的概述与应用

1．2．1 红曲霉的形态与分布

1．2．2 红曲霉所产生的酶系及其应用

1．3 红曲霉产生淀粉酶的发酵研究

1．3．1 发酵条件的优化

1．3．2 发酵培养基的优化

1．4 生淀粉酶的分离纯化

1．4．1 生淀粉酶的分离纯化方法

1．4．2 国内外分离纯化生淀粉酶的研究进展

1．5 生淀粉酶酶学性质研究

1．5．1 生淀粉酶的温度特性

1．5．2 生淀粉酶的pH特性

1．5．3 不同效应物对生淀粉酶的影响

1．5．4 生淀粉酶的酶动力学常数

1．6 立题依据、意义及研究内容

1．6．1 立题依据和意义

1．6．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．2 主要仪器设备

2．3 测定方法

2．3．1 生淀粉酶活力的测定

2．3．2 蛋白质含量的测定

2．4 研究方法

2．4．1．红曲霉产生淀粉酶发酵条件的优化

2．4．2 红曲霉产生淀粉酶培养基的优化

2．4．3 生淀粉酶分离纯化的研究

2．4．4 生淀粉酶酶学性质的研究

3 结果与分析

3．1 红曲霉产生淀粉酶发酵条件的优化

3．1．1 培养温度对酶活的影响

3．1．2 培养基初始pH对酶活的影响

3．1．3 无机盐水量对酶活的影响

3．1．4 培养时间对酶活的影响

3．1．5 最佳培养条件的确定

3．2 红曲霉产生淀粉酶培养基的优化

3．2．1 单因素实验设计确定产酶培养基的组成

3．2．2 Box-Behnken实验设计进一步优化产酶培养基

3．2．3 最佳培养基组成的确定

3．3 生淀粉酶的分离纯化

3．3．1 粗酶液的制备

3．3．2 硫酸铵分段盐析

3．3．3 DEAE-Sepharose fast flow阴离子交换层析

3．3．4 Sephacryl S-200凝胶过滤层析

3．3．5 分离纯化过程汇总

3．3．6 酶的纯度鉴定及分子量的测定

3．4 生淀粉酶的酶学性质

3．4．1 生淀粉酶的最适作用温度

3．4．2 生淀粉酶的热稳定性

3．4．3 生淀粉酶的最适作用pH

3．4．4 生淀粉酶的pH稳定性

3．4．5 金属离子对生淀粉酶的影响

3．4．6 化学物质对生淀粉酶的影响

3．4．7 米氏常数及最大反应速率的测定

4 结论与讨论

5 问题与展望

参考文献

致谢

附录：攻读硕士学位期间发表的论文