黄连素基于PPARγ-IDE信号通路对Aβ代谢的影响及Aβ毒性损伤保护作用的研究

摘要

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经系统退行性疾病,以学习、记忆能力减退和认知功能障碍等为主要临床表现。随着社会老龄化的发展,AD已经成继心血管疾病、肿瘤和中风之后的第四大生命杀手,给家庭和社会带来沉重负担。目前我国有近千万AD患者,是世界上AD患者最多的国家。
　　AD的主要病理特征包括大脑内神经细胞外β淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积形成的老年斑(senile plaques,SPs)、神经细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成的神经元纤维缠结及神经细胞丢失等。AD的发病机制复杂,针对其发病机制有多种学说,其中“Aβ蛋白级联假说”是目前被人们普遍接受的发病机制。该假说认为Aβ产生与清除失衡是导致Aβ过度积累的主要原因。Aβ蛋白主要有两种形式—Aβ40和Aβ42,其中Aβ42是AD患者脑内老年斑的主要成分。Aβ42更易形成寡聚体,能够造成线粒体损伤,引起氧化应激,破坏神经突触功能,诱发炎症反应,最终导致神经元的凋亡。
　　Aβ是由细胞膜上的β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursorprotein,APP)经β-分泌酶和γ-分泌酶两次酶切后生成的产物。因此抑制β-分泌酶和γ-分泌酶的活性或表达均可减少Aβ的生成。其中,β-分泌酶(β-site Amyloid precursor protein Cleaveing Enzyme1,BACE1),即BACE1蛋白,Aβ产生过程中的关键酶和限速酶。众多研究表明,抑制或敲除BACE1基因,可以显著降低APP转基因小鼠大脑中β-分泌酶的表达,减少了脑内Aβ的生成,明显改善了AD模型鼠的学习和记忆能力。提示BACE1可作为治疗AD的靶点。此外,细胞膜上β-淀粉样前体蛋白(APP)表达量的多少也直接影响了Aβ的生成量,因此APP也是AD治疗途径中的重要靶点。
　　机体内还存在Aβ的降解酶,可清除Aβ,减少其在脑内的沉积。Aβ降解酶主要包括胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme,IDE)和中性内肽酶(neprilysin,NEP)等。有研究报道,通过转基因技术将 IDE或 NEP基因导入 AD模型鼠中,可显著提高 Aβ降解酶的清除作用,减少Aβ在脑内的沉积。因此提高Aβ降解酶的表达或活性,促进Aβ的降解作用,也是以Aβ为靶点治疗AD的重要方面。
　　Aβ在脑内可自发聚集,形成多种形态的寡聚体,其中可溶性的寡聚体的神经毒性较强,而单体或不溶性的Aβ多聚体则没有明显的神经毒性。因此,通过药物抑制或降低寡聚态Aβ的毒性,是保护脑内神经细胞,治疗AD的重要策略。
　　综上所述,通过药物干预Aβ的产生或清除过程,改善Aβ的代谢平衡减少累积,或抑制寡聚态Aβ对神经元的毒性作用均是基于Aβ代谢治疗AD的重要策略。目前,临床上治疗AD的药物主要以NMDA受体拮抗剂和胆碱酯酶抑制剂为主,基于Aβ代谢累积治疗AD的药物还是空白。因此,从Aβ代谢积累方面探寻有效治疗AD的天然药物将具有重要研究意义。
　　黄连素(Bberberine,BBR)又称盐酸小檗碱,是从中药黄连中提取的一种天然的异喹啉类生物碱,具有广泛的药理作用,包括抗炎、抑菌、抗氧化应激、抑制胆碱酯酶活性、及对脑组织缺血再灌注损伤的神经保护作用。因黄连素的神经保护作用,受到了AD研究者的广泛重视,前期的一些文献报道说明黄连素能减少 Aβ蛋白的累积,改善AD模型鼠的痴呆症状。但黄连素对Aβ的代谢途径中降解酶方面的影响及对寡聚态Aβ的神经保护作用的研究还未见报道。
　　本研究从黄连素对Aβ代谢的影响及Aβ毒性损伤的保护作用两个方面开展研究:
　　1、通过体外实验研究了黄连素对Aβ产生和降解的影响。结果表明黄连素能以剂量依赖性的方式降低Aβ的表达量。10μM的黄连素使N2a-APP695细胞从细胞内分泌到细胞外液中的Aβ40和Aβ42的量减少33.60±7.65％和39.40±0.93%。随后研究发现黄连素并未影响 Aβ产生途径中的关键蛋白 APP和限速酶 BACE1的表达,而是通过PPARγ-IDE信号途径促进了Aβ的降解,进而减少Aβ的累积。
　　2、通过体外实验研究了黄连素对寡聚态Aβ诱导的N2a细胞毒性损伤的保护作用。研究发现黄连素能以剂量依赖性的方式发挥保护作用,10μM的黄连素组N2a细胞的存活率比单独加入 Aβ组提高了37.11±4.08%。进一步研究发现黄连素的神经保护作用与IDE有关,加入IDE抑制剂后N2a细胞的存活率降低了15.20±3.71%。作用机制可能是黄连素通过PPARγ途径上调IDE蛋白的表达,促进其对细胞外Aβ的降解,降低Aβ的神经毒性作用。

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第1章 前 言

阿尔茨海默病概述

1.1阿尔茨海默病简介

1.2 阿尔茨海默病的病理特征

1.3 AD的发病机制

1.4β-淀粉样蛋白与阿尔茨海默病

1.5 Aβ的产生

1.6 Aβ的降解

1.7以Aβ为靶点的AD的治疗策略

1.8 阿尔茨海默病的药物治疗与黄连素

1.9总结

1.10本论文的研究工作

第2章 黄连素对Aβ代谢的影响及其作用机制

1. 材料与方法

2．结果

3．讨论

4.本章小结

第3章 黄连素对Aβ42诱导的N2a细胞毒性损伤的保护作用及其作用机制研究

1． 材料与方法

2.结果

3.讨论

4.本章小结

全文总结

全文创新点

展望与不足

参考文献

致 谢

攻读学位期间取得的科研成果