银屑病中钙浓度对HaCaT细胞增殖及白细胞介素6表达、分泌的影响研究

摘要

银屑病为皮肤科常见病，其发病机制复杂，多认为与遗传、免疫、感染、外界环境等因素有关。临床上银屑病的治疗方法虽多，但也只能达到暂时缓解的目的，且银屑病病程较长，反复发作不易根治，严重危害人们的身心健康。白细胞介素（interleukin,IL）6是一种重要的细胞因子，在银屑病患者皮损处表达增高并可被角质形成细胞合成分泌。钙离子作为细胞内重要的第二信使参与机体凝血、肌肉收缩、心脏节律正常等多种生理功能外，对角质形成细胞的增殖、分化也有一定影响。为了探讨钙离子与IL-6之间是否存在相关性，本研究通过观察不同浓度钙离子对体外培养人角质形成细胞株 HaCaT增殖的影响及对IL-6 mRNA表达、蛋白分泌的影响初步分析两者间的相关性。
　　目的：探究钙离子对人角质形成细胞株HaCaT增殖的影响及对IL-6mRNA表达、蛋白分泌的影响。
　　方法：用加入不同浓度钙离子的洛斯维RPMI1640培养液[钙离子终浓度分别为0.3毫摩尔/升（mmol/L）、0.5mmol/L、1mmol/L]与RPMI1640培养液（对照组）分别培养HaCaT细胞。培养HaCaT细胞24h、48h时，二甲基噻唑二苯基四盐( MTT)法检测细胞增殖情况；荧光定量聚合酶链反应（qPCR）法检测钙离子对 HaCaT细胞 IL-6信使核糖核酸（mRNA）表达的影响；酶联免疫吸附法（ELISA）检测不同钙离子浓度培养条件下HaCaT细胞上清液中IL-6的分泌量；免疫细胞化学法观察细胞中IL-6的表达，其结果用专业图像分析软件（Image Pro Plus）6.0进行分析。采用独立样本t检验、单因素方差分析和皮尔逊（Pearson）相关分析进行统计学处理。
　　结果：MTT结果显示，在设定浓度下HaCaT细胞的增殖率随着钙离子浓度的增加而增高；与对照组相比，各浓度组培养24h时HaCaT细胞增殖率分别为9.65％?0.57%、29.47%?0.73%、52.18%?1.13%；培养48h时各浓度组 HaCaT细胞增殖率分别为10.23%?0.51%、34.17%?1.14%、57.96%?0.21%。各浓度组培养HaCaT细胞24h时，IL-6 mRNA表达量及其蛋白分泌量随钙离子浓度增加而升高；培养HaCaT细胞48h时， IL-6 mRNA表达量及其蛋白分泌量随钙离子浓度增加而升高。免疫细胞化学结果显示，培养HaCaT细胞24h、48h时，IL-6平均光密度随钙离子浓度增加而升高。相关性分析结果显示，培养HaCaT细胞24h时，钙离子与IL-6 mRNA表达和蛋白分泌均呈正性相关，培养HaCaT细胞,48h时，钙离子与IL-6 mRNA表达和蛋白分泌均呈正性相关。
　　结论：在设定浓度下，钙离子可促进HaCaT细胞的体外增殖，并可在mRNA和蛋白水平促进IL-6的表达和分泌。这可能是银屑病皮损处钙浓度增高导致角质形成细胞增殖和炎症反应加重的原因。

目录

第1章 前 言

1.1 银屑病流行病学简介

1.2 白细胞介素6与银屑病的相关性

1.3 钙离子与银屑病的相关性

1.4 钙离子与白细胞介素6的相关性

第2章 钙离子对HaCaT细胞体外增殖及白细胞介素6表达、分泌影响的实验研究

2.1 材料

2.1.1 人永生化角质形成株HaCaT细胞购自上海吉凯基因化学技术公司

2.1.2 实验试剂

2.1.3 实验仪器

2.1.4 引物

2.2 实验方法

2.2.1 细胞复苏

2.2.2 细胞传代

2.2.3 细胞冻存

2.2.4 MTT法检测钙离子对HaCaT细胞增殖的影响

2.2.5 ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素6蛋白分泌量

2.2.6 荧光定量PCR法检测HaCaT细胞中白细胞介素6基因表达

2.2.7 免疫细胞化学法检测各组细胞中白细胞介素6的表达

2.2.8 统计学分析

2.3 实验结果

2.3.1 不同浓度钙离子对HaCaT细胞增殖的影响

2.3.2 不同浓度钙离子对HaCaT细胞白细胞介素6 mRNA表达的影响

2.3.3 不同浓度钙离子对HaCaT细胞上清液中白细胞介素6蛋白分泌的影响

2.3.4 不同浓度钙离子对HaCaT细胞白细胞介素6蛋白分泌的影响

2.3.5 不同时间各浓度组与HaCaT细胞白细胞介素6 mRNA及白细胞介素6蛋白分泌量的相关性分析

第3章 讨 论

第4章 结 论

研究局限性与展望

参考文献

综述:白细胞介素6在银屑病发病中作用的研究进展

致谢

攻读学位期间取得的科研成果